ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 201S, № S, с. 4S3-460
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =
УДК 577.29;57.086.088;617.7
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНА НУКЛЕОСТЕМИНА В ТКАНЯХ ГЛАЗА ВЗРОСЛОГО ТРИТОНА Pleurodeles waltl
© 2015 г. Ю. В. Маркитантова, П. П. Авдонин, Э. Н. Григорян
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: yuliya.mark@gmail.com Поступила в редакцию 15.02.2015 г.
В тканях глаза взрослого тритона Pleurodeles waltl — хрусталике, сетчатке, ретинальном пигментном эпителии — методом полимеразной цепной реакции с праймерами к гену Ns выявлены нуклеотид-ные последовательности. Секвенированием полученных нуклеотидных последовательностей установлена их принадлежность к гену Ns P. waltl, кодирующему белок ядрышка нуклеостемин. С помощью структурного анализа выявлена высокая степень гомологии нуклеотидных последовательностей Ns P. waltl с таковыми у тритонов Cynopspyrrhogaster и Notophthalmus viridescens. Экспрессия гена Ns P. waltl, обнаруженная в специализированных клетках глаза взрослого тритона исследуемого вида, свидетельствует о сохранении в них некоторых молекулярных характеристик, присущих мало-дифференцированным клеткам.
DOI: 10.7868/S0002332915050082
Исследование "молекулярного портрета" специализированных клеток глаза у низших позвоночных, представителей хвостатых амфибий — взрослых тритонов, обладающих уникальной способностью к регенерации, — один из путей к пониманию механизмов репрограммирования и приобретения клетками новых типов дифферен-цировок. Известно, что дифференцированные клетки пигментированных тканей глаза взрослого тритона — ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и пигментного эпителия радужки — способны в условиях in vivo к конверсии в клетки сетчатки и хрусталика соответственно с восстановлением в итоге полноценных функционирующих тканей (Chiba, Mithashov, 2007; Henry, Tsonis, 2010). Репрограммирование пигментированных клеток глаза у низших позвоночных животных многосторонне изучается (Md. Rafiqul et al., 2014; Григорян, 2015). Задача идентификации генов, которые вовлечены в поддержание пластичности дифференцировки и реализацию возможности репрограммирования генома клетки, остается актуальной.
В последние годы внимание исследователей механизмов пластичности дифференцировки клетки обращено к белкам ядрышка, которые считаются важной составляющей эпигенетического контроля клеточных процессов (Preuss et al., 2008; Bartova et al., 2010). Особый интерес представляет изучение консервативного GTP-связывающего белка ядрышка — нуклеостемина (NS/Ns, GNL3/Gnl3), который вовлечен в передачу митогенных сигналов в клетке (Tsai McKay, 2005). Нуклеостемин был идентифицирован у
беспозвоночных и позвоночных животных в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК), характеризующихся плюрипотентностью и обеспечивающих развитие всего организма, а также в мало-диффенцированных нейральных клетках (Tsai, McKay, 2002; Ma, Pederson, 2008; Rosby et al., 2009; Paridaen et al., 2011).
Нуклеостемину, как и некоторым белкам ядрышка, свойственна высокая транскрипционная активность в пролиферирующих и онкогенных клетках, способность к миграции внутри ядра клетки, связанная с выполнением ряда регуля-торных функций (Sijin et al., 2004; Beekman et al., 2006; Tsai, Meng, 2009; Oktar et al., 2011). Функции нуклеостемина — контроль активности РНК-по-лимеразы I, транскрипции, процессинга рибосо-мальных РНК (рРНК), поддержания стабильной структуры хроматина, репликации ДНК и апо-птоза клеток (Tsai, McKay, 2002; Romanova et al., 2009a, b; Hsu et al, 2012; Lin et al, 2013; Seyed-Gogany et al., 2014). О важности экспрессии гена нуклеостемина для нормального протекания клеточных процессов в эмбриогенезе свидетельствует то, что у мышей с нокаутом по этому гену имеются многочисленные нарушения уже на стадии имплантации эмбриона. В результате это приводит к гибели эмбриона на ранних стадиях развития (Nomura et al., 2009). Показано, что функция гена нуклеостемина, связанная с контролем пролиферации ЭСК и прогениторных клеток в раннем развитии позвоночных животных, закреплена эволюционно (Beekman et al., 2006; Kudron, Reinke, 2008). Интересно также обнаружение экспрессии нуклеостемина в дифференцированных
клетках, где роль этого гена пока еще недостаточно исследована (Hirai et al., 2010).
Цель работы — идентификация гена Ns, кодирующего белок ядрышка нуклеостемин, в специализированных тканях глаза взрослого тритона Pleurodeles waltl (хрусталике, РПЭ и нейральной сетчатке).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили взрослые тритоны P. waltl, разводимые в аквариальной ИБР РАН и широко использующиеся в изучении разных аспектов регенерации тканей и органов. Содержание животных и проведение экспериментов соответствовали биоэтическим правилам РАН и комиссии по биоэтике ИБР РАН. После наркотизации животных в растворе 0.65%-ного NaCl, содержащего MS 222 (1 : 1000), из нативных глаз изолировали хрусталик, сетчатку и РПЭ вместе с сосудистой оболочкой.
Наличие мРНК гена нуклеостемина в тканях глаза изучали с помощью полуколичественного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). РНК выделяли с помощью TRI-реагента (MRC, США), от примесей геномной ДНК избавлялись путем обработки РНК ферментом DNaseTurbo (Ambion, США). Первую цепь кДНК синтезировали с использованием набора Omniscript RT Kit (Quiagen, Германия). Нормирование библиотек кДНК проводили по гену Gapdh P. waltl. Прайме-ры для генов Ns и Gapdh тритона P. waltl конструировали на основе нуклеотидной последовательности из коллекции Expressed Sequence Tag (EST), полученной из личинок тритона этого вида, аннотированной в базе данных GeneBank JG014840.1 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/). Структуры праймеров для Ns P. waltl: 5'-GTCAGCCT-CACTAGTATCAAAG-3' (прямой), 5'-CAGTCG-GAGTGATCATAGTTTC-3' (обратный); размер фрагмента ПЦР 369 пар оснований (п. о.). Структуры праймеров для Gapdh P. waltl: 5'-CGGAAT-CAACGGATTTGG-3' (прямой), 5'-TACT-GAGATGGGTACCTGCG-3' (обратный); размер фрагмента ПЦР 148 п. о. Для конструирования праймеров использовали программу Primer Select (Lasergene DNASTAR, США).
ПЦР с праймерами к гену нуклеостемина проводили на полученных из тканей глаза матрицах кДНК с помощью набора для амплификации (Силекс, Россия) на приборе Mastercycler Personal (Eppendorf, Германия). В качестве маркера длин фрагментов ДНК использовали GeneRuler (Ladder 100 п. о., США). Оценку экспрессии генов проводили с помощью анализатора гелей (UVP LTD, Англия) по интенсивности свечения окрашенных этидием бромидом полос, полученных при электрофоретическом разделении ПЦР-про-
дуктов в 1%-ном агарозном геле. Для секвениро-вания ПЦР-фрагмент элюировали из агарозы с помощью набора GeneClean (BIO 101 Inc., США). Структурный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей нуклеостемина проводили с использованием пакета программ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Lasergene DNASTAR.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
С помощью специфических праймеров методом ПЦР в кДНК-библиотеках из нативных тканей глаза (хрусталика, пигментного эпителия, сетчатки) взрослого тритона P. waltl были получены фрагменты кДНК размером 369 п. о. (рис. 1). В анализируемых тканях глаза изучаемого вида тритона выявлены различия в интенсивности свечения ПЦР-продуктов, полученных с праймерами к гену Ns P. waltl. Обнаруженные различия указывают на относительно более высокий уровень экспрессии гена Ns в сетчатке по сравнению с таковым в хрусталике и РПЭ глаза тритона.
В результате секвенирования и структурного анализа установлена принадлежность полученных фрагментов ПЦР к нуклеотидной последовательности гена нуклеостемина, идентифицированного также в кДНК-библиотеке тритона P. waltl, на личиночной стадии онтогенеза (Ge^Bank JG014840.1). Сравнительный анализ полученной нуклеотидной последовательности гена нуклеостемина тритона P. waltl c гомологами этого гена у Cynops pyrrhogaster (Ge^Bank AB253365.1) и Notophthalmus viridescens (Ge^Bank GQ844313.1) позволил выявить высокое сходство (рис. 2а) гена Ns P. waltl у данных видов из отряда хвостатых амфибий (Urodela). Гомология полученной нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта составила 83.4 и 88.4% у C. pyrrhogaster и N. viridescens соответственно (рис. 2б).
Нуклеотидная последовательность гена Ns P. waltl была переведена в аминокислотную последовательность, сравнение которой у тех же видов тритонов также выявило значительное сходство (рис. 3а). Гомология анализируемой аминокислотной последовательности кодируемого белка нуклеостемина составила 81.1 и 84.7% у C. pyrrhogaster и N. viridescens соответственно (рис. 3б). Результаты исследования позволили сделать вывод, что полученная на матрице кДНК из нативных тканей глаза взрослого тритона нуклеотидная последовательность принадлежит гену Ns P. waltl, ортологи которого высококонсервативны у разных представителей хвостатых амфибий.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В нативных тканях глаза взрослого тритона P. waltl (хрусталике, РПЭ и сетчатке) идентифи-
(a)
148 п. о,-
(б)
369 п. о—
Рис. 1. Результат ПЦР-анализа экспрессии гена Ns P. waltl в нативных тканях глаза взрослого тритона P. waltl. Слева приведены размеры продуктов ПЦР Gapdh (а), Ns P. waltl (б). 1 — маркер длин фрагментов (Ladder, 100 п. о.), 2 — хрусталик, 3 — ретинальный пигментный эпителий, 4 — сетчатка, 5 — контроль специфичности ПЦР-реакции.
цирован ген Ns P. waltl, кодирующий белок ядрышка нуклеостемин. Сравнение первичной структуры полученной методом ПЦР нуклеотид-ной последовательности гена Ns P. waltl, а также соответствующей аминокислотной последовательности кодируемого белка нуклеостемина c таковыми у представителей других хвостатых амфибий (С. pyrrhogaster, N. viridescens), демонстрирует высокую степень гомологии анализируемых последовательностей, а значит, высокую консервативность (рис. 2, 3).
Экспрессия гена Ns, маркера малодифферен-цированных клеток, обнаруженная в специализированных клетках РПЭ у взрослого тритона P. waltl, может быть связана с предполагаемым участием этого гена в молекулярных механизмах поддержания высокой степени пласт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.