научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕГИДРИНОВ В РЕКАЛЬЦИТРАНТНЫХ СЕМЕНАХ КОНСКОГО КАШТАНА Биология

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕГИДРИНОВ В РЕКАЛЬЦИТРАНТНЫХ СЕМЕНАХ КОНСКОГО КАШТАНА»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 6, с. 918-924

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ

УДК 581.1

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕГИДРИНОВ В РЕКАЛЬЦИТРАНТНЫХ СЕМЕНАХ КОНСКОГО КАШТАНА

© 2010 г. Н. А. Гумилевская*, М. И. Азаркович**

*Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва **Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва

Поступила в редакцию 27.01.2010 г.

Исследована фракция термостабильных цитозольных белков в зрелых рекальцитрантных семенах конского каштана (Aesculus hippocastanum L.) в период их покоя и прорастания с целью идентификации и характеристики дегидрин-подобных стресс-индуцируемых полипептидов. В наших экспериментах дегидрин в тканях покоящихся семян выявлялся при иммуноблоттинге в виде одного ярко окрашенного полипептида с мол. м. около 50 кД. Низкомолекулярные термостабильные белки с мол. м. 25 кД и ниже 16 кД, которыми была богата исследованная фракция, не давали реакции на дегидрины. Дегидрин был обнаружен нами во всех частях зародыша: в клетках осевых органов, запасающей паренхимы семядолей и черешков семядольных листьев, что указывает на отсутствие тканевой специфичности в распределении этих белков в семенах конского каштана. Дегидрины выявлялись среди термостабильных белков на протяжении всей стратификации, а также в наклюнувшихся семенах. При наклевывании семян уменьшалась не только сама фракция термостабильных белков, но и относительное содержание в ней дегидринов. Проращивание изолированных осей in vitro в различные сроки стратификации также приводило к исчезновению дегидринов. Если рост изолированных осей ингибировали экзогенной АБК, циклогексимидом или а-аманитином, дегидрины во фракции термостабильных белков сохранялись. Проращивание изолированных осей in vitro в присутствии веществ, не влияющих на их рост или способствующих ему (дегидрозеатин, глюкоза), приводило к исчезновению дегидринов. Это означает, что метаболизм дегидринов тесно связан с процессом прорастания. Дегидрин в семенах конского каштана был способен давать ответ на антитела к убиквитину, что может указывать на участие процесса убиквитинизации в деградации де-гидрина через протеасомную систему при прорастании. Анализ суммарных белков гомогената исследованных нами семян конского каштана позволил выявить помимо 50 кД термостабильного де-гидрина еще один компонент с мол. м. около 80 кД, который локализован во фракции неустойчивых к тепловой денатурации белков, вследствие чего и назван нами дегидрин-подобным белком. Проведенное исследование показало, что дегидрины в семенах конского каштана составляют лишь очень небольшую часть термостабильных цитозольных белков. Роль и функцию мажорных термостабильных белков в семенах конского каштана еще предстоит выяснить.

Ключевые слова: Aesculus hippocastanum — рекальцитрантные семена — дегидрины — покой семян — прорастание

ВВЕДЕНИЕ

Стресс-индуцируемые белки дегидрины представляют собой сложное малоизученное Dll-се-мейство гидрофильных термоустойчивых белков, относящихся к группе белков позднего эмбриогенеза — LEA-белков (от Late Embryogenesis Abundant). По современным представлениям, они синтезируются в ответ на дегидратацию клеток, возникающую при засухе, солевом стрессе, холо-довой акклиматизации, при обработке некоторыми фитогормонами (например, АБК) и в процессе созревания семян. Дегидрины идентифицированы в тканях голо- и покрытосеменных

Адрес для корреспонденции: Азаркович Марина Ивановна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru

растений, в древесных и травянистых видах, в вегетативных органах и семенах. В многочисленных работах с использованием метода иммунолокали-зации было установлено, что дегидрины в растительных клетках встречаются в различных частях клетки — ядре, цитоплазме, цитоскелете, митохондриях. Было показано, что дегидрины не идентифицируются в незрелых зародышах и в молодых проростках. Исследования дегидринов в последние годы проводятся очень активно, о чем свидетельствует появление большого числа обзоров и экспериментальных статей [1—6].

Считается, что дегидрины в ортодоксальных семенах способствуют выработке устойчивости к осмотическому стрессу в период дегидратации семян при созревании. Оказалось, что рекальцит-

рантные семена также способны продуцировать дегидрины, но при этом остаются чувствительными к потере воды. В связи с этим, вопрос о функции и свойствах дегидринов и распространении их в рекальцитрантных семенах становится актуальным. Имеющиеся в настоящее время ограниченные данные указывают на то, что дегидрины присутствуют во многих, но не во всех видах ре-кальцитрантных семян. Они появляются в ответ на низкотемпературный стресс, на повышение содержания АБК и на естественную или искусственную ограниченную дегидратацию. В большинстве случаев дегидрины представлены в виде группы низкомолекулярных термоустойчивых полипептидов. В семенах конского каштана обнаружено несколько дегидриновых белков с мол. м. 12, 14, 18, 30 и 55 кД [7].

Существует предположение, что дегидрины в рекальцитрантных семенах могут обеспечить защиту клеточных структур от повреждающего действия, вызванного низкотемпературным стрессом и действием дегидратирующего фактора.

Ранее нами были исследованы и описаны некоторые физиолого-биохимические особенности семян каштана, охарактеризован протеом осевых органов и семядолей, выявлено сохранение трансляционной активности в клетках изолированных осей и семядолей в период покоя семян при стратификации, установлено отсутствие собственного покоя у изолированных осей и способность их к ростовой активности in vitro [8—12].

Зная полипептидный состав белков осевых органов и семядолей, мы попытались выяснить, какие из полипептидов являются дегидринами, как они распределены в тканях зародыша и какое влияние оказывает на них выдерживание влажных семян при низких положительных температурах (стратификация) и прорастание. Это и явилось целью данной работы. Для этого был использован метод SDS-диск-электрофореза для разделения полипептидов и метод иммуноблот-тинга для выявления дегидринов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Семена конского каштана (Aesculus hippocastanum L.) собирали после опадения в дендрарии ГБС РАН и в парках Москвы. В работе использовали как свежесобранные семена, так и стратифицированные во влажном песке при 5°С в темноте. Перед опытом семена стерилизовали гипохлоритом кальция и отмывали проточной водой. Оси, черешки семядолей и кусочки семядолей отделяли вручную с помощью скальпеля, замораживали или сразу использовали для анализа.

Субклеточное фракционирование гомогената

осей, семядолей и черешков проводили методом

дифференциального центрифугирования, как описано ранее [8]. Замороженные оси (5 штук, общий вес в среднем 250—300 мг), черешки семядолей и кусочки семядолей (весом 250—300 мг) гомогенизировали в 10 мл раствора 0.25 М сахарозы, приготовленного на 0.05 М Трис-НС1-буфере (рН 7.2), содержавшем 0.01 М Mg-ацетата, 0.025 М KCl, 7 мкг/мл пепстатина, 5 мкг/мл лейпептина и 1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид). Гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Аликвоты надосадочной жидкости использовали как источник суммарного белка, остальной экстракт центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин для получения фракции субклеточных структур. Белки постмитохондриального экстракта (цитозоля) разделяли по их отношению к тепловой денатурации (10 мин, 75°С) на термолабильную и термоустойчивую фракции. Коагулировавшие термолабильные белки удаляли центрифугированием, а остающиеся в растворе термостабильные белки осаждали ТХУ. Все образцы белка для электрофореза готовили из ТХУ-оса-жденного материала.

Определение содержания белка в образцах проводили, как описано в работе [13]. Пробы наносили на фильтровальную бумагу Ватман 3 ММ, фиксировали в 10% ТХУ, окрашивали амидовым черным, отмывали от избытка краски, элюирова-ли с бумаги краску, связавшуюся с белком, и ко-лориметрировали при 620 нм. Содержание белка определяли по калибровочной кривой, используя БСА в качестве стандарта.

ДДС-диск-электрофорез проводили в восстановленных диссоциирующих условиях на пластинах геля (0.2 х 12 х 12 см) с градиентом концентрации акриламида от 10 до 20%, а также в 12.5% полиакриламидном геле. Время и условия электрофореза варьировали: 16 ч при 10 мА при комнатной температуре или 5 ч при 30 мА в холодильнике.

За ходом электрофореза следили по движению предокрашенных маркерных белков фирмы "Fermentas". После окончания времени электрофореза разбирали прибор, удаляли концентрирующий гель, а также разделяющий гель ниже линии фронта, отмеченного маркерной краской бром-феноловым синим.

Иммуноблоттинг. Протокол переноса белка на мембрану. Перенос осуществлялся во влажном или погруженном состоянии. Использовали протоколы переноса, описанные в работах [14—16].

Перенос длился 16—18 ч в холодильнике при 30—40 В и 20 мА. После переноса гель окрашивали Кумасси R-250 для оценки полноты переноса белков из геля. Белки на мембране окрашивали Ponceau S в течение 5—10 мин при комнатной температуре (окрашивание обратимое). Затем мембрану споласкивали дистиллированной во-

920

ГУМИЛЕВСКАЯ, АЗАРКОВИЧ

дой до обесцвечивания фона и отмечали положение перенесенных белков и маркеров.

В качестве блокирующего раствора использовали 3% сухое обезжиренное молоко ("АррЦ-СИеш", Германия) в 0.2 М Трис—НС1-буфере, рН 7.4, с добавлением 0.9% ШС1 (ТВ8), содержавшим 0.02% азида № и 0.2% Твин-20, и инкубировали 2 ч при комнатной температуре на качалке или в течение ночи в холодильнике, после чего мембрану удаляли из блокирующего раствора, споласкивали в ТВ (тот же буфер без №С1) и переходили к процедуре добавления антител.

В работе использовали коммерческие кроличьи поликлональные антитела на дегидрины фирмы "81ге88§еп" (США) после их разведения 1 : 1000. 10 мкл исходного раствора первичных антител добавляли к 10 мл ТВ8, содержавшего 0.6% сухого обезжиренного молока, и инкубировали в этом раствор

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком