МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 700-704
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.174.015.3
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА САХАРОЗОСИНТАЗЫ Susi Pisum fulvum
© 2015 г. Е. А. Дьяченко1*, К. В. Борис1, 2, Е. З. Кочиева1, 3
Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва, 117312 2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва, 119991 3Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119234
Поступила в редакцию 10.12.2014 г. Принята к печати 18.01.2015 г.
Ключевые слова: сахарозосинтаза, генетический полиморфизм, Pisum fulvum.
IDENTIFICATION AND POLYMORPHISM STUDY OF SUCROSE SYNTHASE GENE Susl IN Pisum fulvum, by E. A. Dyachenko1*, K. V. Boris1'2, E. Z. Kochieva1'3 (1Bioengineering Center, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117312 Russia, *e-mail: dyachenko-el@yandex.ru; 2V&vilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 3Department of Biology, Moscow State University, Moscow, 119234 Russia).
Keywords: sucrose synthase, genetic polymorphism, Pisum fUlvum. DOI: 10.7868/S0026898415040023
Растения семейства Fabaceae (Бобовые) характеризуются способностью к симбиозу с азотфикси-рующими бактериями рода Rhizobium. Процесс симбиотической азотфиксации, происходящий в корневых клубеньках растений, достаточно энергоемкий и во многом зависит от транспорта и метаболизма сахарозы. Сахароза синтезируется в листьях растений и по флоэме поступает в клубеньки. За метаболизм сахарозы в корневых клубеньках отвечает в основном сахарозосинтаза, фермент, необходимый для симбиотической азотфиксации [1, 2]. Са-харозосинтаза катализирует обратимое превращение сахарозы в присутствии NDP (нуклеозидди-фосфат) в NDP-глюкозу и фруктозу. Активность сахарозосинтазы возрастает в органах, испытывающих дефицит кислорода, таких как, например, корни [3]. Сахарозосинтаза вовлечена также в регуляцию азотфиксации при воздействии абиотического стресса [4].
Известно, что сахарозосинтаза кодируется семейством генов Sus, представленным у всех высших растений. Число генов, кодирующих различные изоформы сахарозосинтазы, может составлять от двух до семи [5]. Так, среди бобовых у лядвенца (Lotus japonicus) выявлено шесть изоформ сахарозосинтазы, а у сои (Glycine max) и конских бобов (Viciafaba) лишь по одной [6, 7].
* Эл. почта: dyachenko-el@yandex.ru
Представители рода Pisum (триба Fabeae (Vicie-ae)) относятся к экономически наиболее значимым бобовым культурам. Этот род включает помимо P. sativum (горох посевной) только вид P. fulvum (горох красно-желтый), ценный источник генов устойчивости к различным фитопатогенам [8-10].
Известны нуклеотидные последовательности мРНК трех изоформ сахарозосинтазы P. sativum — PsSusl, PsSus2 и PsSus3 [11]. Интересно, что кодируемые этими мРНК изоформы относятся к разным группам сахарозосинтаз растений. Так, PsSusl и PsSus3 входят в группу Susl, в то время как PsSus2 — в группу SusA двудольных [12]. Кроме того, существуют различия в характере экспрессии мРНК этих изоформ. Так, ген PsSusl экспрессиру-ется во всех органах, кроме зрелых листьев, а наибольший уровень его экспрессии выявлен в клубеньках, корнях, незрелых зародышах и семенной кожуре. Экспрессия PsSus2, напротив, обнаружена в молодых и зрелых листьях, а PsSus3 — в цветках, семенной кожуре, зрелых листьях, клубеньках и зародыше [11].
Показано, что мутация в гене Susl гороха, вызывающая замену аргинина на лизин, приводит к сокращению активности сахарозосинтазы в клубеньках на 85%, снижению уровня азотфиксации и образованию морщинистых семян [1].
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА САХАРОЗОСИНТАЗЫ
70i
Участие сахарозосинтазы в азотфиксации делает изучение генов, кодирующих данный фермент, и соответствующих белков бобовых растений крайне актуальным. Однако из всего многообразия бобовых культур лишь у люцерны (Medicago truncatula) определены полные нуклеотидные последовательности гена сахарозосинтазы [i3]. У представителей рода Pisum определены последовательности только мРНК сахарозосинтаз P. sativum, а данные о генах Sus P. fulvum отсутствуют.
Цель данной работы заключалась в идентификации полной кодирующей последовательности гена Sus1 P. fulvum и изучении его нуклеотидного и аминокислотного полиморфизма в сравнении с сахарозосинтазами других представителей Fa-baceae.
Для проведения анализа были выбраны три образца P. fulvum различного происхождения (#2523 — Палестина; #702 и #706 — Израиль) из коллекции ВИР (г. Санкт-Петербург). Суммарную ДНК из образцов P. fulvum выделяли с использованием стандартной методики [i4].
Сравнительный анализ проводили с использованием известных нуклеотидных последовательности мРНК генов Sus1 бобовых и гена сахарозосинтазы люцерны из базы NCBI (P. sativum J0i2080, V. faba X69773, M. truncatula AJi3i943, M. sativa AF049487, Vigna radiata VIRVSSi, V. angularis AB495095, PhaseolusvulgarisAF3i5375, G. maxNM00i250596).
На основе данных об известных последовательностях генов сахарозосинтазы бобовых были разработаны праймеры PSUS1F (5'-GAA-GAATTTSAATGGCTACTG) - PSUS4R (5'-MA-AAGCCGGTTYCTYCATTTC), позволяющие ам-плифицировать гены-гомологи Sus1. Амплифи-цированные фрагменты были клонированы, се-квенированы и проанализированы с помощью программы MEGA 5 [15].
Полученные полные нуклеотидные последовательности гена сахарозосинтазы P. fulvum разместили в базе данных NCBI (#702 - KP219422, #706 - KP219423, #2523 - KP219424). Полученные последовательности содержали 13 экзонов и 12 интронов, а их длина варьировала от 3548 (#702) до 3560 (#2523) п.н.
В настоящее время выделяют несколько типов генов сахарозосинтазы, в том числе на основании экзон-интронной структуры [12]. Показана принадлежность полученных нами последовательностей P. fulvum к Sus 1-типу сахарозосинтаз двудольных.
В генах сахарозосинтазы трех образцов P. ful-vum выявлено 66 вариабельных сайтов, общий уровень полиморфизма составил 1.9%. При этом 35 SNP (1.4%) находились в экзонных последовательностях, наиболее полиморфными были экзо-ны VIII и XII (таблица).
Как и ожидалось, интронные последовательности образцов P. fulvum были более полиморфными
Полиморфизм экзонов гена сахарозосинтазы P. fulvum и родственных видов бобовых
Экзон, п.н. Уровень полиморфизма экзонов, % (число вариабельных сайтов)
P. fulvum триба Fabeae (Pisum, Vicia) сем. Fabaceae*
II (98) i.0 (i) 4.i (4) 25.5 (25)
III (i27) 0.8 (i) 4.7 (6) 27.6 (35)
IV (i52) 0.7 (i) 2.0 (3) i7.8 (27)
V (i93) i.0 (2) 3.6 (7) i9.7 (38)
VI(336) i.2 (4) 6.0 (20) i9.9 (67)
VII (96) 0.0 4.2 (4) 22.9 (22)
VIII (i74) 4.6 (8) 7.0(i2) 22.4 (39)
IX (ii7) 0.0 4.3 (5) ii.i (i3)
X(i67) 0.0 4.2 (7) i7.4 (29)
XI (225) i.3 (3) 4.4 (i0) 23.i (52)
XII (564) 2.5 (i4) 6.4(36) 23.i (i30)
XIII (i39) 0.7 (i) i.4 (2) i5.i (2i)
XIV (36) 0.0 2.8 (i) i6.7 (б)
Все экзоны: (242i) i.4(35) 4.8 (ii7) 20.8 (504)
* Medicago (триба Trifolieae), Vigna, Phaseolus, Glycine (триба Phaseoleae).
702
ДЬЯЧЕНКО и др.
* Pisum fulvum Pisum sativum
Vicia faba Medicago sativa Medicago truncatula Vigna radiata Vigna angularis Glycine max Phaseolus vulgaris
Pisum fulvum Pisum sativum Vicia faba Medicago sativa Medicago truncatula Vigna radiata Vigna angularis Glycine max Phaseolus vulgaris
Pisum fulvum Pisum sativum Vicia faba Medicago sativa Medicago truncatula Vigna radiata Vigna angularis Glycine max Phaseolus vulgaris
Pisum fulvum Pisum sativum Vicia faba Medicago sativa Medicago truncatula Vigna radiata Vigna angularis Glycine max Phaseolus vulgaris
Pisum fulvum Pisum sativum Vicia faba Medicago sativa Medicago truncatula Vigna radiata Vigna angularis Glycine max Phaseolus vulgaris
Pisum fulvum Pisum sativum Vicia faba Medicago sativa Medicago truncatula Vigna radiata Vigna angularis Glycine max Phaseolus vulgaris
Аминокислотные последовательности белка Sus1 P. fulvum и анализируемых видов бобовых. * Аминокислотные последовательности трех образцов P. fulvum инвариантны.
(2.7%) и помимо SNP содержали в интроне IX де-лецию 7 п.н. (MTWCATG) (в положении +1958) у образца #702 и инсерцию 5 п.н. (TAGTT) (в положении + 1979) у образца #2523.
Представлялось интересным сравнить последовательности генов сахарозосинтаз P. fulvum и единственных известных на сегодняшний день мРНК гена Susi представителей трибы Fabeae — P. sativum и V. faba. Так, внутриродовой полиморфизм Pisum (P. fulvum—P. sativum) составил 2.3%, уровень полиморфизма между образцами P. fulvum и V. faba был выше (4.5%). Наиболее полиморфными были экзоны VI и XII (таблица).
Включение в анализ известных последовательностей Susi других представителей семейства Fa-baceae привело, как и ожидалось, к выявлению значительно более высокого уровня различий. Всего в экзонных последовательностях Susi бобовых отмечено 504 вариабельных сайта, или 20.8%. Наиболее полиморфными были экзоны II и III (таблица). Наибольшее число замен было в последовательности гена Susi Ph. vulgaris.
В настоящее время отсутствуют данные о внутривидовом полиморфизме сахарозосинтаз бобовых, однако можно оценить уровень межвидовой
вариабельности этого гена у представителей Vigna (V. radiate, V. angularis) и Medicago (M. sativa, M. trun-catula), который составляет 1.5 и 1.7% соответственно. Полученные нами данные позволили впервые определить уровень межвидового полиморфизма кодирующей области гена Susi у представителей рода Pisum (P.fulvum, P. sativum), который оказался несколько выше, чем у родов Vigna и Medicago, и составил 2.3%.
Неожиданно высоким оказался уровень внутривидового полиморфизма кодирующей последовательности Susi в образцах P. fulvum (1.4%), сопоставимый с уровнем межвидового полиморфизма у представителей родов Vigna и Medicago. Причины столь высокого уровня различий не ясны и представляют интерес в связи с достаточно узким ареалом распространения P. fulvum, ограниченным Ближним Востоком.
Последовательность экзонов гена Susi была транслирована in silico и проанализирована. Протяженность полученного белка составила 806 аминокислотных остатков. Из 35 нуклеотидных зам
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.