ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 636.085.3:577.18:543
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И КОРМАХ МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С МАТРИЧНО (ПОВЕРХНОСТЬЮ)-АКТИВИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИЕЙ/ИОНИЗАЦИЕЙ © 2015 г. В. Г. Амелин*, **, Т. А. Краснова*, **
*Федеральный центр охраны здоровья животных 600901 Владимир, мкр. Юрьевец **Владимирский государственный университет им. Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых 600000 Владимир, ул. Горького, 87 1Е-таИ: amelinvg@mail.ru Поступила в редакцию 09.03.2014 г., после доработки 02.06.2014 г.
Предложены методики идентификации и определения остаточных количеств антибиотиков различных классов в пищевых продуктах и кормах для животных методом масс-спектрометрии с матрично (поверхностью)-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МС МАЛДИ/ПАЛДИ). Показано, что для извлечения антибиотиков эффективен ацетонитрил без стадии очистки экстракта. Пределы обнаружения антибиотиков в указанных продуктах при соотношении сигнал/шум, равном 4, составили 0.01—0.3 мкг/кг для метода МС МАЛДИ и 0.001—0.03 мкг/кг для метода МС ПАДДИ. Относительное стандартное отклонение результатов определения антибиотиков не превышает 0.1 в кормах и премиксах в диапазоне определяемых содержаний при навеске корма 1.0 г 20—400 мг/кг для монензина и наразина, 0.2—200 мг/кг для тилмикозина и 20—1000 мг/кг для авиламицина. Продолжительность анализа составляет 40—50 мин.
Ключевые слова: МС МАЛДИ/ПАЛДИ, антибиотики, идентификация, определение, пищевые продукты, корма.
Б01: 10.7868/80044450215070026
Использование различных антибиотиков в ветеринарии для предотвращения заболеваний птицы и скота иногда приводит к их появлению в продуктах питания животного происхождения (мясо, яйца, молоко и пр.). Употребление в пищу продуктов, содержащих остаточные количества антибиотиков, наносит существенный вред здоровью человека. В соответствии с действующей нормативной документацией антибиотики в продуктах животного происхождения определяют микробиологическими методами, основанными на использовании бактерий, чувствительных к антибиотикам и на их способности размножаться в продуктах питания [1]. Кроме того, для определения антибиотиков используют твердофазный иммуноферментный анализ [2]. Микробиологические исследования и иммуноферментный анализ требуют сложной пробоподготовки, а продолжительность анализа достигает несколько часов.
В последнее десятилетие появились новые методики определения некоторых антибиотиков методом тандемной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Например, в работе [3] предложена методика определения хлорамфеникола в мясе и морепродуктах. Предложена [4] методика одновременного определения 120 антибиотиков различных классов в почках животных. Такие методы требуют тщательной очистки экстракта антибиотиков от со-экстрагирующихся примесей (белки, жиры, липи-ды и пр.) при твердофазной экстракции.
С учетом сложности стадии пробоподготовки в перечисленных выше методах продолжается поиск более простого способа идентификации и определения антибиотиков. Один из развивающихся методов исследования органических соединений — масс-спектрометрия с матрично (поверхностью)-активи-рованной лазерной десорбцией/ионизацией в соче-
тании с времяпролетным масс-анализатором [5, 6]. Описано определение данным методом антибиотика монензина в почве, воде и моче с использованием в качестве матрицы коллоидного серебра [7], тилозина, тилмикозина, спирамицина и эритромицина в моче с использованием в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты [8].
Цель настоящей работы состояла в демонстрации возможностей метода МС МАЛДИ/ПАЛДИ при идентификации антибиотиков в пищевых продуктах животного происхождения и определении антибиотиков в кормах и премиксах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Аппаратура. Использовали масс-спектрометр МАЛДИ с времяпролетным масс-анализатором Autoflex III smartbeam (Bruker Daltonik, Германия); режим работы с рефлектроном для положительных и отрицательных ионов в диапазоне масс 200—7000 Да (стандартный режим PepMix), основные параметры при выполнении исследований: ультрафиолетовый азотный лазер с длиной волны 337 нм, длина импульса 3 нс, мощность лазерного излучения 106—107 Вт/см2. Масс-спектры регистрировали с использованием программы FlexControl ver. 3.3. Спектры анализировали с использованием программы FlexAnalysis ver. 3.3 (Bruker Daltonik, Германия). Для нанесения проб применяли стальную подложку MTP 384 ground steel TF и одноразовую подложку с неорганическими нанонитями Nano-sysMSP 96 (Bruker Daltonik, Германия).
Реактивы. В качестве матриц использовали 4-гид-рокси-3,5-диметоксикоричную, а-циано-4-гидрок-сикоричную (ЦГКК), 2,5-дигидроксибензойную кислоты, а также наноповерхность NanosysMSP 96 (Bruker Daltonik, Германия).
Для градуировки масс-спектрометра при работе в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов PepMix применяли стандартную смесь пептидов (Peptide Calibration Standard, Bruker Daltonik, Германия), состоящую из 7 соединений: ангиотензина I (1047.19 Да), ангиотензина II (1297.49 Да), вещество Р (1348.64 Да), бомбезина (1620.86 Да), АКТГ 1-17 (2094.43 Да), АКТГ 18-39 (2466.68 Да), соматостатина 28 (3149.57 Да). Использовали стандартные образцы индивидуальных антибиотиков: монензина, наразина, авиламицина (Eli Lilly & Company, США); тилмикозина, канами-цина, неомицина, стрептомицина, дигидростреп-томицина, ласалоцида, лаидломицина, эритромицина, салиномицина, джозамицина, спирамицина, рифабутина, семдурамицина, мадурамицина, ти-лозина (Sigma-Aldrich, Швейцария); спектиноми-цина, ивермектина, абамектина, рифампицина, амикацина, полимиксина сульфата, валиномици-
на, бацитрацина, цефтиофура (Dr. Ehrenstorfer, Германия). Растворы антибиотиков с концентрацией 1 мг/мл готовили растворением соответствующих навесок в ацетонитриле. Рабочие растворы готовили в день использования разбавлением исходных ацетонитрилом. Для приготовления матриц с концентрацией 20 мг/мл применяли ацетон (Эко-химтех, Россия), трифторуксусную кислоту (Sigma-Aldrich, Швейцария). Для пробоподготовки применяли ацетонитрил (Prolabo, Австрия), MgSO4, NaCl (Panreac, Испания), натрий лимоннокислый трехза-мещенный двойной гидрат Na3C6H5O7 • 2H2O, натрий лимоннокислый двухзамещенный полуторный гидрат Na2C6H5O7 • 1.5Н2О (Sigma-Aldrich, Швейцария), сорбенты Bondesil-PSA, Discovery DSC-18 (Supelco, США). Применяли деионирован-ную воду сопротивлением не ниже 18.2 МОм, полученную на установке Water Pro PS (Labconco, США).
Подготовка проб. Молочные продукты. Отбирали 5.0 г молока или молочного продукта в пластиковую пробирку емк. 50 мл, приливали 10.0 мл аце-тонитрила и 5.0 мл деионированной воды, встряхивали в течение 5 мин и добавляли 4 г NaCl, интенсивно встряхивали 1—2 мин и центрифугировали 5 мин со скоростью 4500 об/мин.
Продукты животного происхождения. Отбирали 5.0 г гомогенизированного пищевого продукта в пластиковую пробирку емк. 50 мл, приливали 10.0 мл ацетонитрила, встряхивали в течение 15 мин и центрифугировали 5 мин со скоростью 4500 об/мин.
Применение QuEChERS. В центрифужную пробирку емк. 50 мл вносили навеску анализируемой пробы 5.0 г, добавляли 10.0 мл ацетонитрила, 0.1 мл конц. муравьиной кислоты, закрывали пробирку и энергично взбалтывали в течение 1 мин. Затем вносили смесь 4.0 г MgSO4, 1.0 г NaCl, 1.0 г Na3C6H5O7 • • 2H2O и 0.5 г Na2C6H607 • 1.5 Н2О. После внесения солей взбалтывали в течение 1 мин (во избежание образования комков) и центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 4500 об/мин, отбирали 5 мл верхней части экстракта и переносили в центрифужную пробирку емк. 15 мл, которая содержала смесь сорбентов Bondesil-PSA (0.15 г), С18 (0.15 г) и MgSO4 (0.9 г). Пробирку энергично встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали 5 мин со скоросью 2700 об/мин.
Полученные экстракты смешивали с матрицей (а-циано-4-гидроксикоричная кислота, 20 мг/мл) в объемном соотношении 1 : 1 и 1 мкл смеси наносили на стальную подложку MTP 384 ground steel TF в методе МС МАЛДИ или с бидистиллированной водой в объемном соотношении 1 : 1 и 1 мкл смеси наносили на подложку Nanosys MSP 96 в методе МС ПАЛДИ.
х 105
3.0
В В
13 2.0 $
о
о «
m S
о «
S «
И
1.0
1
llii
ji
К
+
« «
l-H
я
200
400
600
800
m/z
Рис. 1. Масс-спектр а-циано-4-гидроксикоричной кислоты при регистрации положительных ионов.
Идентификацию антибиотиков проводили путем сравнения масс-листов, полученных спектров с массами основных ионов антибиотиков, полученных при исследовании индивидуальных стандартов (с учетом природного изотопного соотношения).
Определение антибиотиков в кормах и премиксах. Отбирали 1.0 г гомогенизированного корма или 0.05 г премикса в пластиковую пробирку емк. 50 мл, приливали 9.0 мл ацетонитрила и 1.0 мл де-ионированной воды, встряхивали в течение 15 мин и центрифугировали 5 мин со скоростью 4500 об/мин. Полученный экстракт смешивали с внутренним стандартом — раствором джозамицина с концентрацией 10 мкг/мл в соотношении 1 : 1 (по объему). Смесь анализируемого раствора и внутреннего стандарта смешивали с матрицей (а-циано-4-гидроксикоричная кислота) в объемном соотношении 1 : 1 и 1 мкл смеси наносили на стальную подложку.
Для характеристики эффективности пробоподготовки использовали степень извлечения (R):
с V
R = сж!к х 100, CqVq
где ск и с0 — концентрации аналита в конечном анализируемом растворе и в исходной пробе, Ук и У0 — объемы конечного анализируемого раствора-концентрата и пробы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследовали несколько классов антибиотиков, широко применяемых в ветеринарии, — мак-ролидов, ионофоров, полипептидов, цефалоспори-нов, аминогликозидов и др. (табл. 1). Установлено, что для работы с данными веществами оптимальным является стандартный режим с рефлектроном при регистрации положительных ионов — RP Pep-Mix. В режиме работы с отрицательными ионами (RN PepMix) пики ионов антибиотиков в масс-спектрах не обнаружены. Оптимальный уровень интенсивности пиков аналита достигнут при 55%-ной мощности лазера
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.