научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ МАРКЕРАМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИДЕНТИЧНОГО НАБОРА ПЦР-ПРАЙМЕРОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ МАРКЕРАМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИДЕНТИЧНОГО НАБОРА ПЦР-ПРАЙМЕРОВ»

БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2013, том 39, № 6, с. 459-466

= Методы исследований

УДК 574+575 ПОПУЛЯЦИОННАЯ ГЕНЕТИКА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ МАРКЕРАМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИДЕНТИЧНОГО НАБОРА ПЦР-ПРАЙМЕРОВ1

© 2013 г. Л. А. Животовский, Е. Г. Шайхаев, М. В. Шитова

Институт общей генетики им. И.И. Вавилова РАИ,Москва 119991 e-mail: levazh@gmail.com

Статья принята к печати 28.03.2013 г.

Разработан набор гомологичных праймеров, позволяющих одновременно амплифицировать микросателлит-ные маркеры у широкого набора видов лососевых рыб. Это создает основу для решения ряда проблем природоохранной биологии и генетики лососевых: 1) определения видовой принадлежности особи или биологического образца; 2) выявления гибридных особей; 3) оценки генетических характеристик биоразнообразия лососевых рыб в бассейне исследования; 4) индивидуализации биологических образцов, т.е. тестирования на принадлежность их одной и той же особи; 5) определения популяционной принадлежности рыб.

Ключевые слова: лосось, идентификация, гибрид, микросателлит, ДНК-штрихкодирование, биоразнообразие.

Identification of salmonid fish using microsatellite markers and identical PCR-primers. L. A. Zhivotovsky, E. G. Shaikhaev, M.V. Shitova (N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow 119991)

A set of homologous primers were designed to provide the amplification of microsatellite markers in a variety of salmonid species. They can help in solving the problems associated with the genetics and conservation biology of salmonids: (1) species identification; (2) determination of interspecific hybrids; (3) genetic estimation of salmonid biodiversity in a watershed; (4) individualization of tissue samples, i.e., testing on their belonging to the same individual; (5) identification ofthe fish origin. (Biologiya Morya, 2013, vol. 39, no. 6, pp. 459-466).

Keywords: salmon, identification, hybrid, microsatellite, DNA barcoding, biodiversity.

В связи с ростом воспроизводства, вылова и увеличения продукции лососевых рыб возникает необходимость идентификации биологических образцов (крови, кожи, мышц и др.) для определения их видовой и индивидуальной принадлежности. Чтобы выяснить, от какого вида получен исследуемый биологический образец, используют методы ДНК-идентификации, одним из которых является ДНК-штрихкодирование - анализ нуклео-тидной последовательности локуса цитохром с оксидазы I, COI (Hebert et al., 2003). В частности, показано, что с помощью этого метода можно различать виды тихоокеанских лососей, однако он не позволяет идентифицировать биологические образцы, т.е. выяснить, принадлежат они одной особи или разным особям одного вида, поскольку внутривидовая изменчивость по локусу COI крайне мала (Rasmussen et al., 2009). По этой же причине на основе данного метода нельзя определить популяци-онную принадлежность особи, кроме того, он неэффективен при природоохранных исследованиях, связанных с оценкой генетических компонентов биоразнообразия. Другие недостатки ДНК-штрихкодирования - невозможность идентифицировать гибриды, поскольку ген COI локализован в митохондриальной ДНК, наследуе-

мой по материнской линии, а также необходимость сек-венирования, что не всегда удобно и доступно.

Указанные недостатки можно устранить при использовании ДНК-маркеров со следующими свойствами: они аутосомные; виды по ним хорошо различаются; характеризуются высоким внутривидовым полиморфизмом; просты для генотипирования, стоимость анализа относительно невысока. Таковыми являются микросателлиты. Действительно, подавляющее большинство микросателлитных локусов находится в аутосомах (за исключением специально выбранных в половых хромосомах) и обладает значительным внутривидовым полиморфизмом, который можно выявить методами капиллярного электрофореза или электрофореза в блоке полиакриламидного геля, а при значительных различиях в размере аллелей можно использовать крахмальный или агарозный гель, хотя при этом число выявляемых аллелей будет меньше (Wang et al., 2009). Для определения генотипа особи по данному микросателлитному локусу применяют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий амплифицировать (копировать) достаточное количество фрагмента ДНК, содержащего

1 Работа поддержана грантами программ Президиума РАН "Живая природа: динамика генофондов" и ОБН РАН "Биологические ресурсы России".

исследуемый локус. Этот фрагмент определяется окаймляющими данный локус праймерами - фланкирующими участками ДНК, которые задают границы амплифици-руемого фрагмента.

Для успешного применения указанного подхода необходимо выбрать микросателлитные локусы, по которым виды заметно дивергировали друг от друга. Поскольку трудно подобрать локусы с неперекрывающимися аллельными спектрами сразу по многим видам, одновременно используют несколько микросателлит-ных маркеров. При этом возникает проблема оптимизации анализа каждого маркера, так как для исследования одного и того же микросателлита у разных видов обычно используют разные праймеры, разработанные исследователями для конкретных популяционных экспериментов. Однако использование таких видоспеци-фичных праймеров намного усложняет и удорожает исследование, поскольку число пар праймеров для каждого локуса, которые необходимо одновременно приобрести, хранить и проанализировать, равно количеству видов, к которым можно отнести исследуемый биологический образец. В то же время для каждого локуса лишь одна пара праймеров окажется действительно необходимой для идентификации образца. Например, если из предварительных данных известно, что исследуемый биологический образец взят у одного из шести видов тихоокеанских лососей, то для каждого исследуемого маркера потребуется шесть разных пар праймеров. При использовании, скажем, пяти микросателлитных локусов потребуется одновременно приобрести, а затем хранить 30 разных пар праймеров, что слишком обременительно. Упростить анализ микросателлитов можно через межвидовую оптимизацию ПЦР - разработку для данного микросателлитного локуса универсальной пары праймеров, которая позволит амплифицировать этот маркер у всех исследуемых видов. В таком случае в нашем условном примере при исследовании шести видов лососей по пяти локусам вместо 30 разных пар праймеров потребуется только пять пар. Эта оптимизация существенна и при создании региональных реперных баз данных. Кроме того, при изучении межвидовых гибридов трудно установить генотип гибридной особи, если оба аллеля не амплифицируются одновременно в одной ПЦР-реакции. Поэтому оптимизация анализа микросателлитных локусов у разных видов является актуальной задачей.

Даже у близких видов, разделенных длительной репродуктивной изоляцией, в гомологичных участках, фланкирующих микросателлитный локус, могут возникнуть мутации. Вследствие таких мутаций амплификация аллелей разных видов в данном локусе с помощью одной и той же пары праймеров становится невозможной. Лишь поиск фланкирующих участков ДНК, нуклео-тидная последовательность которых у сравниваемых видов идентична или почти идентична, даст возможность подобрать соответствующие универсальные праймеры.

Цель данной работы - проверить осуществимость оптимизации ПЦР и исследовать характер изменчивости

одновременно амплифицируемых микросателлитных локусов у лососевых рыб, время дивергенции которых порядка 10 млн. лет. В качестве базового набора видов как экономически наиболее важные были выбраны тихоокеанские лососи и дополнительно - некоторые другие виды лососевых рыб Дальнего Востока.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Исследовали три рода лососевых рыб подсемейства Salmoninae (семейство Salmonidae), распространенные на Дальнем Востоке. Наиболее полно в материале представлены тихоокеанские лососи: кета (Oncorhynchus keta, 44 экз.), горбуша (О. gorbuscha, 44 экз.), чавыча (О. tschawytscha, 44 экз.), нерка (О. пегка, 42 экз.), кижуч (О. kisutch, 42 экз.) и сима (О. masou, 44 экз.). Кроме того, были исследованы микижа (О. mykiss, или Parasalmo mykiss, 43 экз.), два вида гольцов: белый голец (Salvelinus albus, 44 экз.) и кунджа (S. leucomaenis, 44 экз.), а также сахалинский таймень (Parahucho perryi, или Hucho perryi, 22 экз.). Образцы (небольшие фрагменты плавников рыб, фиксированные в 96% этаноле) большинства видов были собраны в нижнем течении р. Камчатка (п-в Камчатка, 2008 г.), за исключением горбуши (р. Курилка, о-в Итуруп, 2007 г.), симы (р. Очепуха, о-в Сахалин, 2007 г.) и сахалинского тайменя (р. Даги, о-в Сахалин, 2009 г.).

ДНК из собранных биологических образцов выделяли при помощи набора "Diatom DNA prep 200" ООО "Лаборатория Изоген". Для проведения ПЦР-амплификации использовали набор реагентов "GenPak PCR Core" ООО "Лаборатория Изоген", содержащий ингибированную для "горячего старта" Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозид трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями соответственно 1 U, 200 мкМ и 2.5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения ПЦР. Конечный объем смеси для ПЦР 20 мкл, конечная концентрация праймеров в реакции 0.1-0.5 мкМ, количество ДНК 20-100 нг. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе "Applied Biosystems 9800 Fast Thermal Cycler". Программа амплификации включала следующие стадии: 1) предварительная денатурация при 95°С - 1 мин; 2) 32 цикла: 95°С - 20 с, 56-58°С - 20 с, 74°С - 30 с; 3) заключительный синтез при 74°С - 2 мин. Фрагментный анализ проводили на приборе для капиллярного электрофореза QIAxcel фирмы QIAGEN®, размеры аллелей определяли, используя программное обеспечение BioCalculator software фирмы QIAGEN®, на основании набора фрагментов ДНК, имеющих размер от 76 до 556 п.н. (пар нуклеотидов) с шагом 24 п.н.

Для сравнительного изучения микросателлитного полиморфизма у выбранных видов предварительно исследовали 14 микросателлитных локусов: OtsG69> и OtsG%5 (Williamson et al., 2002), ОЫ02 (Nelson, Beacham 1999), Ots2\\ (Greig et al., 2003), One 103 и ОпеЮ9 (Olsen et al., 2000), OMMW31, ÖMM1050 и ÖMM1121 (Rexroad III et al., 2002), ÖMM1070 (Rexroad III et al., 2001), Ofo lO и Oki2 (Smith et al., 1998), Ssa\97 (

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»