ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 2, с. 87-93
НОВЫЕ МЕТОДЫ И МОДЕЛИ ^^^^^^^^^^ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ
УДК 597-114.78:639.371.13
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЛА У РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ ONCORHYNCHUS MYKISS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ
ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
© 2015 г. Ю. П. Рудь, М. И. Майстренко, Л. П. Бучацкий
Институт рыбного хазяйства НААН Украины 03164, Украина, Киев, ул. Обуховская, 135 E-mail: irido1@ bigmir.net Поступила в редакцию 16.01.2014 г. Окончательный вариант получен 09.10.2014 г.
На основе полимеразной цепной реакции разработан экспресс метод диагностики пола у радужной форели Onchorhynchus mykiss. Используя данные из банка геномов NCBI были проанализированы нуклеотидные последовательности специфического полового локуса лососевых видов рыб и подобраны олигонуклеотидные праймеры. Размеры продуктов амплификации составляли 800 пар нук-леотидов. Специфичность амплификации была проверена нуклеотидным анализом последовательности ампликонов. Все продукты ПЦР отвечали участку Y хромосомы, в котором находится исследуемый специфический локус. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов полового маркера радужной форели и других лососевых видов рыб показал высокую степень идентичности, которая составляла 95—99%. Максимальная идентичность последовательностей в 99% наблюдалась при анализе представителей одного рода, например Onchorhynchus. Таким образом, пол может быть определен с помощью обычной ПЦР, что позволит идентифицировать самцов реверсантов во время процесса гормональной реверсии пола у рыб. Данный метод относится к экспресс-диагностике, поскольку анализ данных и возвращение результатов в рыбное хозяйство проводится на протяжении одних суток. Также результаты вскрытия брюшной полости реверсантов радужной форели и изучения их гормонального статуса представлены в данной работе.
Ключевые слова: радужная форель, реверсия пола, полспецифический ДНК-маркер, ПЦР.
DOI: 10.7868/S0475145015020081
ВВЕДЕНИЕ
Интерес к полу некоторых видов рыб, особенно лососевых и осетровых, обусловлен двумя основными причинами. Одна из них — это получение однополых самок с целью наработки больших количеств икры, и вторая — эти рыбы являются удобной моделью изучения дифференциации пола низших позвоночных.
Изучение хромосом костистых рыб показало, что у многих из них половые хромосомы морфологически не различимы. Однако, у самцов некоторых видов лососевых рыб (радужная форель O. mykiss, и озерная форель Salmo trutta) морфологические различия хромосом все же имеются (Phillips, Rab, 2001). Локус, определяющий пол у лососей имеет небольшие размеры. С ним тесно связаны последовательности, кодирующие гормон роста, некоторые ферменты и микросателлиты (Allendorf et all., 1994). Генетическими исследованиями было установлено, что, в зависимости от вида лососей, степень их сцепления с пол-
опредиляющим участком SEX не одинакова. Особый интерес в регуляции дифференцировки пола у лососевых рыб играет именно гормон роста. Известно, что гормон роста участвует в регуляции синтеза стероидов в половых железах рыб. Также у лососевых рыб были обнаружены гены, аналогичные некоторым генам млекопитающих, которые имеют большое значение в процессе дифференцировки пола — Sox-9a, Sox9b, AMH, WT1 и другие (Асланян, Солдатова, 2009). В настоящее время разработано большое количество молекулярных маркеров для различных видов лососевых рыб. Для речной форели известны такие маркеры, как Omyl, Omy8, Omy9, для чавычи Otyl, Oty3 и другие (Brunelli et al., 2008). Было установлено, что Oty1 является частью большого фрагмента Oty8, повторяющегося в геноме в виде 300 копий. Положение молекулярных маркеров на половой хромосоме можно определить с помощью метода FISH-гибридизации. Установлено, например, что маркер Otyl расположен на теломерном участке
Таблица 1. Схема внесения гормонов для реверсии пола у радужной форели O. mykiss на хозяйстве "Ишхан"
Декада Масса рыбы, г % гормона от корма Количество корма, кг Расход гормона, г
день декада
1 0.150 5 0.0075 0.075 0.225
2 0.225 5 0.0112 0.112 0.33
3 0.34 5 0.017 0.17 0.51
4 0.51 5 0.025 0.25 0.75
5 0.715 4 0.03 0.3 0.9
6 1 4 0.4 0.4 1.2
7 1.4 4 0.056 0.56 1.68
8 1.96 4 0.8 0.8 2.4
9 2.75 4 1.1 1.1 3.3
Всего гормона 11.07
малой акроцентрической Y-хромосомы (Devlin, Nagahama, 2002). Изучение генетических факторов, обуславливающих реверсии пола лососевых рыб, имеет большое практическое значение.
В последние годы количество хозяйств, выращивающих однополых самок возрастает. Получение таких самок проводят в два этапа. На первом этапе получают однополых самцов-реверсантив. Затем, при скрещивании их с обычными самками получают однополых самок. Получение однополых самцов-реверсантов (ХХ) достигается путем обработки молодых особей рыб низкими дозами андрогенов. Именно в этот период развития рыб возможна эффективная реверсия пола. Обычно с этой целью используют такие андрогены как метил-тестостерон, метилдегидростерон (МДНТ), или гидроксиандростенидион. Полученные таким образом самцы состоят из двух типов:
1. Фенотипические самцы с женским генотипом (содержат 2Х хромосомы). Эти однополые самцы (реверсанты) при скрещивании с обычными самками дадут в потомстве 100% самок с генотипом ХХ.
2. Самцы с естественным генотипом (содержат как Х, так и Y хромосомы).
Эти два вышеупомянутых типов самцов фено-типически между собой не отличаются. Различия между ними можно обнаружить только при гистологических исследованиях, или путем реци-прокных скрещиваний, что занимает большое количество времени. Поэтому в последние годы для ускоренного выявления самцов-реверсантов (с ХХ генотипом) во многих странах были разработаны молекулярно-биологические методы, основанные на ДНК-технологии. Применение этих методов стало возможным после обнаружения канадскими исследователями в чавыче O. tshawytscha и озерной форели на Y-хромосоме последователь-
ностей ДНК, повторяющиеся (около 200 раз), размерами 8, 16, 24 и 32 т.п.н. (Devlin R.H., Nagahama Y, 2002). Была разработана ПЦР-диагностика самцов вышеуказанных рыб, широко используемая в современном рыбоводстве. Для диагностики выделяют из плавников или крови ДНК, при этом рыба остается живой. Целью нашей работы была разработка метода ПЦР для выявления Y-хромо-сомы среди реверсантов радужной форели.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Получение реверсантов. Опыты по реверсии пола проводили на базе форелевого хозяйства "Ишхан" в Черновицкой области Украины. Для получения реверсантов в корм добавляли гормон метилтестостерон 17-альфа в дозе 3 мг/кг корма и скармливали в течение 50 дней, а затем заменили этот гормон на тестостерон пропионат, который скармливали в течение 40 дней. Скармливание корма с добавлением двух форм гормонов начали в период, когда личинки радужной форели перешли на внешнее питание. Срок скармливания корма с гормонами составлял 90 суток. Корм скармливали по мере его поедания рыбой, но из расчета не более 5% от массы рыбы в течение 1—4 декады, и 4% в остальные дни (табл. 1). Видовой состав стероидных гормонов и их концентрацию подбирали согласно проанализованным литературным данным (Metalnikova, 2008, Павлов и др., 2010).
Идентификация пола у радужной форели O. mykiss методом полимеразной цепной реакции. Выделение ДНК К гомогенату из плавников радужной форели добавляли лизирующий буфер (10 мМ Tris-HCl pH = 8.0, 0.1 М NaCl, 25 мМ ЭДТА, 0.5% ДСН) и протеиназу К, тщательно перемешивали и инкубировали один час при температуре 37°C. ДНК экстрагировали фенолом и центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин на микроцентрифуге
"Ependorf" (Германия). Надосадочную жидкость отбирали и проводили повторную экстракцию ДНК смесью хлороформ—изоамиловый спирт (24 : 1). Суспензию центрифугировали на микроцентрифуге в течение пяти минут при 13000 об/мин. К супернатанту добавляли 0.1 объем 3 М натрий ацетата (рН 5.2) и 2.5 объема охлажденного до —20°C этанола. Преципитацию ДНК проводили при —20°C в течение 10 ч. После этого осаждали ДНК на микроцентрифуге при 13000 об/мин в течение 10-ти минут. Осадок ДНК промывали 70% этанолом. ДНК растворяли в ТЕ-буфере (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH = 7.5) или в деионизирован-ной воде (ThermoScientific) (Sambrook, 2001). Концентрацию очищенной ДНК радужной форели измеряли на спектрофотометре "APEL PD-303 UV" с использованием кварцевых кювет.
Подбор олигонуклеотидных праймеров. Подбор олигонуклеотидных праймеров, определение их специфичности и физических свойств, а также анализ последовательностей ДНК фрагментов Y хромосом некоторых видов лососевых, взятых из базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI), проводили с помощью программного обеспечения Vector NTI 10 и онлайн-сервиса BLAST (www.ncbi.nim.nih.gov/blast). Последовательность олигонуклеотидных праймеров была такой: OmYF1 5' - CAAGTCGGGCAGCG-GCAAGTC - 3' и OmYR2 - GGGAGCCTTG-TAGTAAAAGACGC - 3'.
Полимеразная цепная реакция. В состав реакционной смеси входило: 12.5 мкл смеси ПЦР Master Mix Green (ThermoScientific), по 10 pM каждого олигонуклеотида (Metabion), 1 мкл ДНК радужной форели и стерильная деионизированная вода до общего объема 25 мкл. Амплификацию проводили на термоциклере PeqStar 96 Gradient (PEQLAB, Германия). Амплификация ДНК включала 1 цикл предварительной денатурации при 95°C (2 мин) и 35 циклов денатурации при 95°C (1 мин), отжига праймеров при 60°C (1 мин), синтеза при 72°C (1 мин) и дополнительный последний цикл синтеза при 72°C (2 мин). После ПЦР продукты анализировали в 2% агарозном геле в ТАЕ-буфере (40 мМ Tris-HCl, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА). Маркером служил 100 п.н. ДНК-маркер (ThermoScientific). Результаты электрофореза наблюдали под ультрафиолетовым трансиллюминатором.
Определение нуклеотидной последовательности. Выделение ДНК из геля осуществляли с помощью набора Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (ThermoScientific) соответственно протоколу производителя.
Нуклеотидные последовательности ДНК радужной форели исследовали на автоматическом ДНК-секвенаторе "Genetic Analyser 3130" ("Applied Biosystems", США) с использованием набора для секвенирования ("BigDye®
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.