МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, том 41, № 4, с. 616-623
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 577.212.3
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СИЛИКАТЕИНОВ ПРЕСНОВОДНОЙ ГУБКИ Lubomirskia baicalensis
© 2007 г. О. В. Калшжная1*, А. С. Беликова1, Е. П. Подольская2, А. Г. Красько3,
W. E. G. Müller3, С. И. Беликов1
Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск, 664033 2Институт аналитического приборостроения Российской академии наук, Санкт-Петербург, 190103 3lnstitut für Physiologische Chemie, lohann Gutenberg Universität, Mainz, D-55099, Germany
Поступила в редакцию 07.09.2006 г. Принята к печати 06.10.2006 г.
Кремниевые спикулы байкальской пресноводной губки Lubomirskia baicalensis содержат несколько белков, включая силикатеины. При анализе клонотеки кДНК L. baicalensis обнаружено четыре различных мРНК, кодирующих белки, родственные силикатеину а морских губок (а1, а2, а3 и а4). Определена интрон-экзонная организация гена силикатеина а1, выделенного из геномной ДНК. Длина этого гена от инициирующего кодона до терминирующего равна 1988 п.н., он состоит из шести интронов (общим размером 1007 п.н.) и семи экзонов (всего 981 п.н.). С использованием масс-спектрометрического анализа в триптическом гидролизате белков спикул обнаружены пептиды двух силикатеинов а.
Ключевые слова: губки, Lubomirskia baicalensis, биогенный кремнезем, силикатеин, экзон-интрон-ная организация, масс-спектрометрический анализ, триптический гидролизат.
SILICATEINS IDENTIFICATION OF THE FRESHWATER SPONGE L. baicalensis, by O. V. Kaluzhnaya1*, A. S. Belikova1, E. P. Podolskaya2, A. G. Krasko3, W. E. G. Müller3, S. I. Belikov1 ^Limnological Institute, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Irkutsk, 664033 Russia, *e-mail: oksana@lin.irk.ru; 2Institute for Analytical Instrumentation, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, 190103 Russia; 3Institut für Physiologische Chemie, Iohann Gutenberg Universität, Mainz, D-55099, Germany). Siliceous spicules of the freshwater Baikal sponge Lubomirskia baicalensis contain several proteins including silicateins. Existences of four different genes of silicatein а (а1, а2, а3, а4) which are related to silicatein а from the sea sponges were found when cDNA library analysis was made. The intron-exon structure of the full-size silicatein а1 gene was determined. This gene has total length of 1988 bp and includes 6 introns (1007 bp) and 7 exons (981 bp). With use of mass-spectrometric analysis of the spicule proteins tryptic digest, two silicateins а were authentically found.
Key words: sponges, Lubomirskia baicalensis, biogenic silica, silicatein, exon-intron structure, mass-spectro-metry, tryptic digest.
В последнее время внимание исследователей привлекают процессы усвоения кремниевой кислоты растениями и животными, связанные с отложением биогенного кремнезема. У диатомовых водорослей найден белок - силаффин, способствующий поликонденсации кремниевой кислоты с образованием наносфер разного размера, которые затем генетически контролируемым образом укладываются на внешней поверхности клетки с образованием изящных структур-створок диато-мей [1]. У губок, древнейших представителей жи-
Принятые сокращения: МС-анализ - масс-спектрометри-ческий анализ; SDS - додецилсульфат натрия; ПААГ - по-лиакриламидный гель; БСА - бычий сывороточный альбумин; dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфаты.
*Эл. почта: oksana@lin.irk.ru
вотных, сохранившихся до настоящего времени, биогенный кремнезем откладывается в виде спикул, связанных спонгином, с образованием внутреннего скелета губок. Спикулы губок класса Бето8ро^1ае, представляющие собой заостренные цилиндры из полимера кремниевой кислоты, содержат осевую нить из органического вещества. Вероятно, спикулы образуются в два этапа. На первом этапе внутри клетки образуется осевая нить, вокруг которой откладывается кремнезем с образованием тонкой спикулы, длина которой близка длине зрелой спикулы. Второй, внеклеточный этап приводит к формированию полноразмерной спикулы [2]. В спикулах морских губок после растворения их в плавиковой кислоте или ее солях найдены силикатеины - белки, гомо-
логичные сериновой протеазе катепсину L [3]. Основное отличие силикатеинов от катепсинов -мутация в активном центре катепсина, приводящая к замене Cys на Ser. Силикатеины обладают способностью гидролизовать эфиры кремниевой кислоты с образованием аморфного кремнезема [4-6]. В настоящее время неизвестно, каким образом губки синтезируют эфиры кремниевой кислоты, но опубликован предполагаемый механизм действия силикатеина [4], и у морских губок обнаружены мРНК, кодирующие два родственных белка - силикатеины а и в [5, 7].
Для лучшего понимания механизма действия силикатеинов необходимо изучение их структуры у различных морских и пресноводных губок. Пресноводные губки представляют особый интерес в связи с тем, что это эволюционно более молодая группа, чем морские губки. Пресноводные губки появились, вероятно, около 150 млн. лет назад в позднемеловую (Early Cretaceous) эпоху [8], в то время как морские губки сформировались ранее, не менее 600 млн. лет назад, в Прекембрии (Early Vendían) [9]. Исключительным видовым разнообразием пресноводных губок отличается древнейшее глубоководное озеро Байкал, где по современным данным обитают 18 видов губок, 13 из которых образуют эндемичное семейство Lubomirskiidae [10]. Эндемичные байкальские губки населяют прибрежную часть озера, покрывая сплошным ковром дно на глубине 5-40 м [2].
В задачи настоящего исследования входил поиск генов силикатеинов у байкальской пресноводной губки Lubomirskia baicalensis, определение нуклеотидных последовательностей их кДНК, анализ организации гена силикатеина, выделенного из геномной ДНК, а также подтверждение присутствия кодируемых обнаруженными генами белков в спикулах губки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Сбор образцов. Образцы байкальской губки L. baicalensis были собраны в районе поселка Большие Коты (юго-западное побережье оз. Байкал) на глубине 10-15 м. Экземпляры, которые использовали далее для выделения ДНК, замораживали в жидком азоте и хранили при -20°С.
Выделение спикул. Препараты спикул получали согласно [3] с некоторыми модификациями. Губки отжимали для удаления гелеобразного содержимого и выдерживали в 1%-ном растворе до-децилсульфата Na (SDS) при температуре 60°С. Затем скелеты губок, состоящие из спонгина и спикул, вновь отжимали, тщательно промывали водой до полного обесцвечивания и высушивали на воздухе. К 50 г сухого скелета губок добавляли 500 мл смеси концентрированных азотной и сер-
ной кислот в соотношении 1 : 4, и полученную массу перемешивали до полного растворения спонгина. Отделяли осадок спикул губок и вновь обрабатывали его 100 мл смеси кислот для удаления оставшегося органического вещества. Затем спикулы отмывали водой и кипятили с 1%-ным SDS в течение получаса. Спикулы отделяли фильтрацией в вакууме, промывали водой и ацетоном и высушивали на воздухе. Вес сухих спикул составил 24 г или 48% от сухого веса скелета губки.
Растворение спикул. Процесс растворения спикул в плавиковой кислоте с одновременным окрашиванием аксиального филамента красителем Кумасси (Coomassie brilliant blue R250) наблюдали с использованием светового микроскопа Axiovert-200 ("Carl Zeiss"). Для выделения белков спикул использовали модифицированный метод [3]: 2 г спикул растворяли в 150 мл смеси 2 M HF/8 M NH4F (pH 5) в течение 2 ч, затем раствор диали-зовали против 1 л дистиллированной воды при 4°С. Воду заменяли минимум 3 раза через каждые 2 ч. Не растворимые в воде белки отделяли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин и хранили при 4°С.
Электрофорез. Белок, экстрагированный из спикул, анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующем ПААГ [11]. Белки суспендировали в буфере (6 х Orange Loading Dye Solution, "Fermentas", Литва), инкубировали 5 мин при 95°C, а затем наносили на двухфазный денатурирующий гель (концентрирующий - 10%, разделяющий - 5%) и проводили электрофорез (125 В, 2 ч). После электрофореза гель окрашивали красителем Кумасси [11].
Анализ нуклеотидных последовательностей.
Для получения клонотеки кДНК L. baicalensis суммарную РНК из свежих образцов губок выделяли с использованием TRIZOL REAGENT ("Sigma") по протоколу фирмы. Клонотеку кДНК получали по методике, прилагающейся к набору SMART™ cDNA Technology ("Clontech").
Суммарную ДНК для определения полной нуклеотидной последовательности гена силикатеина а1 губки выделяли из образцов L. baicalensis, хранящихся в 70%-ном этаноле, с использованием набора QIAGEN RNA/DNA, согласно рекомендациям производителя. Выделенную ДНК анализировали электрофорезом в 0.6%-ном геле агарозы.
Скрининг клонотеки кДНК для поиска последовательностей, кодирующих силикатеины а, проводили путем амплификации суммарной клонированной кДНК со специфическими праймера-ми, выбранными на основе анализа опубликованных структур генов, в сочетании с универсальными плазмидными праймерами, специфичными к
промоторам фагов Sp6 и Т7. Структуры специфических праймеров приведены ниже, указано их
положение в нуклеотиднои последовательности кДНК силикатеина a Suberites domuncula:
LB_Sil_f1 - CAGGGAGATTGTGGTGCCAGCTATGC (394-419), LB_sil_r2 - ATGCCGCATTGGTTGTACTTGTT (940-962).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, pH 8.9, 4 мМ MgCl2, 40 мМ KCl, 0.1 мг/мл БСА, 0.2 мМ каждого dNTP, по 1 мкМ прямых и обратных праймеров, 1-10 нг ДНК и 12 ед. акт. Taq-полимеразы, по программе: 30 циклов, включающих плавление - 94°С, 70 с; отжиг 55°С, 90 с; полимеризацию 72°С, 120 с.
Полную нуклеотидную последовательность гена силикатеина а1 определяли в несколько этапов, получая перекрывающиеся ампликоны. Использовали следующие праймеры (в скобках указано их положение в полной нуклеотидной последовательности гена):
LB_SilUT_F - GCATTCCTTGCGAAGTACTGA (1-21), LB_gensil_F - GTATTATACTTTTCAGCTTGGCGAGTT (50-76), LB_sil_F1 - TGGGGACACTTACACTGCCTTCA (1342-1364), LB_sil_R2 - ATGTTGGTCACCGGGTACGGATCG (1788-1812), LB_gensil_R
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.