ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 463, № 3, с. 358-361
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
ИММУНИЗАЦИЯ ПЕПТИДОМ 189-205, ПРОИЗВОДНЫМ СЕРОТОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА ПОДТИПА 1В, МЕНЯЕТ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ К ГОРМОНАМ В МОЗГЕ КРЫС
© 2015 г. К. В. Деркач, Е. А. Шпакова, И. И. Тарасенко, О. А. Жарова, А. О. Шпаков
Представлено академиком РАН Н.П. Веселкиным 09.09.2014 г. Поступило 24.09.2014 г.
Цель работы состояла в изучении влияния многократной (12 месяцев) иммунизации крыс БСА-конъюгатом пептида 189—205, производным второй внеклеточной петли С1ВР крысы, на активность АЦСС в мозге иммунизированных животных (группа "С1Р") и ее регуляцию гормонами.
DOI: 10.7868/S0869565215210239
Изучение молекулярных механизмов регуляции биохимических процессов и физиологических функций в ЦНС — одна из приоритетных задач современной биохимии и нейробиологии. Важнейшую роль в этих механизмах играют серо-тониновые рецепторы подтипа 1В (С1ВР), которые широко представлены в разных отделах головного и спинного мозга. С1ВР относятся к рецепторам серпантинного типа, которые через посредство гетеротримерных Огбелков сопряжены с ферментом аденилатциклазой (АЦ) [1]. С1ВР вовлечены в контроль высвобождения моноаминов, подавляют передачу сигналов через глутама-тергические нейроны. Нарушение их функций приводит к депрессивным состояниям, мигрени, гиперактивности, тревожности [2]. Однако сравнительно мало известно о том, как длительное ингибирование С1ВР влияет на нейрональную пластичность и нейромедиаторные системы мозга. Также отсутствует информация о влиянии нарушений в С1ВР-сигнальных каскадах на активность аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС), которая играет исключительно важную роль в передаче сигналов в ЦНС. Для длительного выключения С1ВР используют мышей с нокаутированным геном этого рецептора, но потомство этих мышей имеет дефекты серотонинергической системы [3]. Более перспективным является подход, основанный на выработке специфичных антител к внеклеточным петлям рецепторов, что ве-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской Академии наук, Санкт-Петербург E-mail: alex_shpakov@list.ru
дет к ингибированию их функциональной активности [4]. Нами для этого был синтезирован пептид QAKAEEEVSEC(Acm)-VVNTDH189-205-A-амид (Acm — ацетамидометильная группа), который структурно соответствует второй внеклеточной петле С1ВР крысы. С целью повышения им-муногенности пептид конъюгировали с БСА.
Цель работы состояла в изучении влияния многократной, на протяжении года, иммунизации крыс-самцов конъюгатом БСА-пептид 189— 205 С1ВР на функциональную активность АЦСС в мозге иммунизированных животных и на ее регуляцию моноаминами и пептидными гормонами, в том числе агонистами СР. В задачи работы также входило исследование ряда метаболических показателей и параметров функционирования щитовидной железы у иммунизированных крыс.
Пептид 189—205 С1ВР синтезировали с помощью твердофазного синтеза на пара-метилбензгидрил-аминной смоле, используя защищенные Na-mpem-бутилоксикарбонильными группами аминокислоты, как описано ранее [5]. Структуру пептида подтверждали с помощью ESI-масс-спектрометрии высокого разрешения на приборе MicroTOF ("Bruker Corporation", США) в режиме регистрации положительных ионов. По данным масс-спектрометрии экспериментальная масса пептида составила 2027.86 Да, что совпадает с рассчитанной для него массой — 2027.92. Для получения конъюгата 0.15 мкмоль БСА и 30-кратный молярный избыток пептида 189—205 С1ВР растворяли в 1 мл 0.1 М К+-фосфатного буфера (pH 8.0), к полученному раствору по каплям в течение 1 ч (25°C) добавляли 300 мкл 21 мМ раствора глута-рового альдегида, перемешивали 3 ч и очищали полученный БСА-конъюгат с помощью хромато-
ИММУНИЗАЦИЯ ПЕПТИДОМ 189-205
359
графии на колонке с сорбентом Sephadex G-75 ("Sigma-Aldrich", США).
Иммунизацию крыс популяции Wistar (группа "С1Р", n = 6) начинали в полуторамесячном возрасте и проводили восьмикратно — в первый, 30, 60, 90, 190, 300, 320 и 360-й дни эксперимента. Животным подкожно в межлопаточную область вводили БСА-конъюгат пептида 189—205 С1ВР. Для первой иммунизации использовали БСА-конъюгат в полном адъюванте Фрейнда, для второй и третьей — БСА-конъюгат в неполном адъюванте (в соотношении 1 : 1, 400 мкл), для последующих иммунизаций — только БСА-конъюгат. Дозы БСА-конъюгата составили при первом и втором ведениях 20 мкг, при третьем — 40 мкг, в дальнейшем — по 50 мкг на крысу. Контрольных крыс (группа "К", n = 6) обрабатывали по такой же схеме, но без конъюгата. Иммунный ответ оценивали с помощью непрямого иммунофер-ментного анализа на планшетах с иммобилизованным пептидом 189—205 С1ВР. Сорбцию пептида на иммунобиологическом пластиковом планшете Nunc MaxiSorp ("Thermo Fisher Scientific, Inc.", Дания) проводили в соответствии с рекомендациями фирмы "Nalge Nunc International" (Дания). Полуколичественная оценка титра антител к БСА-конъюгату пептида 189—205 С1ВР показала, что в конце эксперимента у всех шести иммунизированных животных отмечался высокий титр антител к пептиду, в то время как в группе "К" антитела выявлены не были.
Для проведения биохимических экспериментов использовали серотонин, дофамин, бромокриптин, изопротеренол, норадреналин, 8-гидрокси-2-ди-пропиламинотетралин (8-OH-DPAT), соматоста-тин, а-меланоцитстимулирующий гормон (а-МСГ), гипофизарный АЦ-активирующий поли-пептид-38 (PACAP-38), релаксин, форсколин, 5'-гу-анилилимидодифосфат (ГИДФ) производства "Sig-ma-Aldrich", 5-нонилокситриптамин (5-НОТ) и 5-хлор-2-метил-3-(1,2,3,6-тетрагидро-4-пиридинил)-Ш-индол (EMD-386088) — "Tocris Cookson Ltd." (Великобритания). Для определения активности АЦ использовали [а-32Р]АТФ (1000 Ки/ммоль, ОАО Всерегиональное объединение "Изотоп", Россия).
Выделение фракций синаптосомальных мембран из коры, стриатума и гиппокампа мозга крыс проводили, как описано ранее [6]. Животных подвергали декапитации через 13 месяцев после начала эксперимента. Активность АЦ определяли по методу [7] и выражали в пмоль цАМФ/мин на мг мембранного белка. Ферментативную реакцию проводили в течение 12 мин при 37°C. Ингибирующие эффекты гормонов оценивали по их влиянию на активность АЦ, стимулированную форсколином (10—5 М).
Уровень глюкозы в крови определяли с помощью тест-полосок ("One Touch Ultra", США) и глюкометра ("Life Scan Johnson & Johnson", Дания), концентрацию инсулина — с помощью набора Rat Insulin ELISA ("Mercodia AB", Швеция), уровни свободного (fT4) и общего (tT4) тироксина и общего трийодтиронина (tT3) — с помощью наборов ИФА-СвТ4-1, ИФА-ТТ4-1 и ИФА-ТТ3-1 (ЗАО "НВО Иммунотех", Россия), концентрацию триглицеридов, общего холестерина и холестерина, связанного с липопротеидами низкой (ЛПНП) и высокой плотности (ЛПВП), — с помощью наборов фирмы "Ольвекс Диагностикум" (Россия).
Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы ANOVA. Данные представлены в виде M ± SD для трех независимых экспериментов. Различия считали достоверными приp < 0.05.
Масса тела в группе "С1Р" на всем протяжении эксперимента существенно не отличалась от таковой в контроле и через 13 мес составила 431 ± ± 22 г (в контроле — 452 ± 15 г). Уровни глюкозы и инсулина достоверно не различались и составили в группе "С1Р" — 3.8 ± 0.2 мМ и 6.2 ± 0.7 мкЕД/мл, в группе "К" — 4.1 ± 0.2 мМ и 5.7 ± 0.4 мкЕД/мл. У иммунизированных животных в тесте с глюкоз-ной нагрузкой не было выявлено изменений толерантности к глюкозе: через 120 мин после инъекции уровень глюкозы (6.1 ± 0.9 мМ) снижался практически до контрольных значений (5.7 ± 0.7 мМ). В группе "С1Р" не было выявлено при сравнении с контролем изменений липидного статуса, на что указывает отсутствие достоверных различий в концентрациях триглицеридов, общего холестерина, холестерина-ЛПВП и холестерина-ЛПНП, а также в соотношении холестерин-ЛПНП/холе-стерин-ЛПВП (данные не представлены).
В то же время через 12.5 мес у иммунизированных животных менялся гормональный статус щитовидной железы. Уровни 1Т4, Я4 и в группе "С1Р" составили соответственно 18.4 ± 3.0 пМ, 67.6 ± 5.9 и 2.34 ± 0.37 нМ, что на 30, 14 и 15% ниже, чем в группе "К", причем для 1Т4 различия были достоверными (p < 0.05). Впервые обнаруженное нами снижение функций гипоталамо-ги-пофизарно-тиреоидной оси в условиях длительного ослабления С1ВР-зависимых сигнальных путей позволяет предположить, что С1ВР вовлечены в регуляцию этой оси. Ранее другими авторами были получены данные о модулирующем влиянии тиреоидных гормонов на функции серотони-нергической системы мозга, в том числе на экспрессию и процессинг С1ДР и С1ВР [8, 9], но данные о влиянии серотонина и С1ВР-агонистов на гипоталамо-гипофизарно-тиреоидную ось отсутствуют.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 463 № 3 2015
360
ДЕРКАЧ и др.
Прирост активности АЦ, пмоль цАМФ/мин на мг белка 100 г
80
60
40
20
X
I—| Группа "К" I—I Группа "С1Р"
^ Л
-Ь,
Рис. 1. Стимулирующие эффекты гормонов на активность аденилатциклазы в синаптосомальных мембранах мозга контрольных и иммунизированных крыс. (а) — серотонин, (б) — БМВ-386088, (в) — дофамин, (г) — норадреналин, (д) — изопротеренол (все — 10"5 М), (е) - РАСАР-38 (10—6 М), (ж) - релаксин (10—8 М), (з) - а-МСГ (10-7 М). Здесь и на рис. 2 результаты представлены в виде М ± * — р < 0.05 по сравнению с контролем.
Стимулирующий эффект форсколина на активность АЦ, %
100 г ,_, г
I | 1руппа "К"
* □ Группа "С1Р"
80
60
40
20
X
X
б
Рис. 2. Ингибирование гормонами стимулированной форсколином активности АЦ в мозге контрольных и иммунизированных крыс. (а) — серотонин, (б) — 5-НОТ, (в) — 8-ОН-ВРАТ, (г) — бромокриптин, (д) — норадреналин; концентрация (а—д) — 10—5 М, (е) — со-матостатин (10 М). Стимулирующий эффект форсколина (10—5 М) на активность АЦ в отсутствие гормонов принят за 100%.
*
*
0
б
а
в
г
д
е
ж
з
0
а
в
г
д
е
Далее мы исследовали функциональное состояние АЦСС в синаптосомальных мембранах, выделенных из мозга иммунизированных крыс. Ба-зальная активность АЦ и ее стимуляция негормональными агентами (ГИДФ, форсколином) в гру
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.