их экспрессии не всегда может адекватно отражать содержание в клетках самих ауксинов.
Количественный анализ ауксинов (даже применение таких чувствительных методов, как им-муноанализ и ГЖХ в сочетании с масс-спектро-метрией [16, 17]) также не позволяет определять их содержание в отдельных тканях и клетках. Такую возможность открывает сочетание иммуно-химических подходов с гистологическими. Однако в литературе крайне редко можно встретить работы, в которых применялся данный подход для изучения распределения ауксинов между клетками корней [11].
Мы применили метод иммунного окрашивания для изучения распределения ауксинов между клетками тканей корня растений пшеницы и кукурузы. Было изучено два воздействия, которые могут влиять на формирование боковых корней: гравистимуляция и удаление придаточных корней. Выбор гравистимуляции связан с тем, что, по данным литературы, возникновение градиента ауксинов под воздействием стимулов, сопровождающих тропические изгибы, может быть одним из гипотетических механизмов инициации боковых корней [10]. Удаление придаточных корней было выбрано в связи с тем, что оно стимулирует ветвление оставшегося главного корня предположительно за счет сформированных до воздействия примордиев боковых корней [18]. Было показано накопление ауксинов в оставшемся главном корне [18, 19]. Однако определение суммарного содержания ауксинов в экстракте из корней не позволяло судить о том, как распределились ауксины между клетками корня.
В настоящей работе с помощью метода иммунного окрашивания изучали распределение ауксинов в тканях корня при гравистимуляции и удалении придаточных корней, и полученные этим методом данные сопоставляли с результатами количественного определения ауксинов. Цель работы состояла в выявлении особенностей распределения ауксинов в корнях как фактора, определяющего формирование боковых корней.
МЕТОДИКА
Для изучения распределения ИУК в грависти-мулированных корнях семена гибрида кукурузы (Zea mays L.) СГ5 МВ стерилизовали с помощью перманганата калия и замачивали в течение 30 мин в водопроводной воде. Затем их раскладывали на стекле с фильтровальной бумагой и помещали в камеру, насыщенную влагой, для проращивания в термостате в темноте при 27-28°С. Трехдневные проростки размещали таким образом, что их корни находились в вертикальном положении в насыщенной парами воды камере. В таком положении растения находились еще сутки, и затем 4-дневные
проростки на 2 ч помещали горизонтально в насыщенную парами воды камеру (гравистимуляция). Для того, чтобы отличать верхнюю и нижнюю половинки корня, делали косой срез так, что нижняя половина была длиннее. Это позволяло в дальнейшем контролировать пространственную ориентацию срезов при их изучении под микроскопом. При количественном определении ауксинов ориентированную вверх поверхность корня помечали, посыпая натертым графитом, отделяли кончик (0.5 мм) и разрезали зону растяжения (1.5 мм) на верхнюю и нижнюю половинки. Содержание ауксинов определяли в 30 собранных кусочках корней.
При изучении образования боковых корней у проростков пшеницы (Triticum durum Desf. сорта Безенчукская 139) зерновки проращивали в темноте на водопроводной воде при температуре 22-25°C. Затем проростки на плотиках переносили в контейнеры, заполненные 10%-ным раствором питательной среды Хогланда-Арнона, и помещали на светоплощадку при 450 мкмоль/(м2с) ФАР и 14-часовом фотопериоде. Температура воздуха в течение светового периода была в пределах 22-25°С. Объектом исследования служили корни 78-дневных проростков пшеницы. За день до начала экспериментов растения с удаленной зерновкой помещали в стаканы со 100 мл питательного раствора для адаптации. У проростков удаляли все четыре придаточных корня, оставляя каждый раз главный (самый длинный) корень. Корни удаляли под водой с помощью острого лезвия, не повреждая ксилемные сосуды и таким образом предотвращая их закупорку воздухом. Через определенные промежутки времени после удаления корней, указанные в табл. 2, из оставшегося главного корня и главного корня интактных растений экстрагировали ИУК. Число боковых корней и их примордиев на главном корне определяли в конце суток после операции под микроскопом после фиксации материала по Кларку в смеси этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (3 : 1) и окрашивания ацетокармином [7]. Для гистологического окрашивания примордиев боковых корней брали отрезок около 4 мм на расстоянии 1.5-2 см от кончика корня.
Экстракцию и очистку ИУК проводили по стандартной схеме. ИУК экстрагировали 80%-ным этанолом. После упаривания спиртового экстракта до водного остатка ауксины очищали путем экстракции в диэтиловый эфир и реэкстрак-ции по модифицированной схеме, как описано ранее [16]. Для определения содержания ауксинов в экстракте из корней пшеницы применяли обычный метод иммуноферментного анализа [20].
В экспериментах с гравистимуляцией для определения содержания ауксинов в 30 половинках кончиков корней кукурузы длиной около 1.5 мм,
весивших всего несколько миллиграмм, применяли твердофазный метод иммуноферментного анализа ИУК с усилением сигнала (модификация метода Self [21]). Вместо используемых при стандартном варианте метода диагностических антител, меченных пероксидазой, добавляли антитела, меченные щелочной фосфатазой ("ICN", США) при разведении 1 : 20000. После промывки планшета в лунки вносили 0.02 М диэтаноламиновый буфер (рН 9.5), содержавший 0.01% НАДФ и 1 мМ Mg2+ и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. К окисленному субстрату приливали усилитель: 0.075 М Трис-НС1-буфер (рН 7.5), содержавший 0.001% диафоразы, 0.02% алкогольдегидрогеназы, 0.075% хлорида йодонитротетразолия и 3.8% этанола. Оптическую плотность образовавшегося раствора формазана определяли на спектрофотометре Ti-tertek-Uniscan ("EPLAB", Финляндия) при длине волны 490 нм. Использование иммуноферментного метода с усилением сигнала повышало чувствительность реакции в 10 раз и позволяло анализировать содержание ИУК в небольших навесках.
Для предотвращения вымывания ИУК из тканей в процессе фиксации и дегидратации отрезки корней длиной 4 мм фиксировали в течение 4 ч 4%-ным раствором карбодиимида (1-этил-3-(3-диметилами-нопропил)карбодиимид, "Sigma", США). Инфильтрацию тканей карбодиимидом проводили под вакуумом в течение первых 30 мин фиксации. При этом ИУК за счет карбоксильных групп связывалась с аминогруппами белков. После обезвоживания в растворах этанола возрастающих концентраций (до 96%) образцы заключали в метакрилатную смолу (JB-4, "Electron Microscopy Sciences", США) в соответствии с рекомендацией производителя. С помощью ультрамикротома готовили гистологические срезы толщиной 0.5 мкм и размещали по 4 среза на предметных стеклах. Иммунолокализацию ИУК проводили, как описано ранее [22]. Срезы обрабатывали 0.1 М Na-фосфатным буферным раствором (рН 7.3), содержавшим 0.2% желатина и 0.05% Твина-20 (ФЖТ), в течение 30 мин. На часть срезов наносили 20 мкл сыворотки кролика против ИУК, полученной, как описано ранее [16], разведенной в ФЖТ в соотношении 1 : 80. Специфичность иммунного окрашивания проверяли, обрабатывая другие срезы неиммунной сывороткой в том же разведении. Срезы прикрывали полосками па-рафилма и инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в течение 2 ч. После инкубации срезы промывали трижды по 10 мин 0.1 М Na-фосфатным буферным раствором, содержавшим Твин-20 в конечной концентрации 0.05% (ФТ). На каждый срез помещали 20 мкл меченных коллоидным золотом иммуноглобулинов козы против антител кролика ("BioCell", Великобритания), разведенных в ФЖТ в соотношении 1 : 200. Срезы покрывали кусочками парафилма и инкубировали в течение 1 ч во влажной камере при
комнатной температуре. Затем их промывали три раза по 10 мин в ФТ и ополаскивали дистиллированной водой. После высушивания срезы в течение 20 мин обрабатывали препаратом серебра для усиления окрашивания в соответствии с рекомендацией производителя ("BюCeП").
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение ауксинов между клетками кончика корня на продольном срезе гравистимулиро-ванных корней проростков кукурузы представлено на рис. 16. На этом рисунке видно неравномерное окрашивание на срезах корней, которые в течение 2 ч находились в горизонтальном положении. Следует отметить, что окрашивание было наиболее интенсивным в области перицикла (на границе коры и центрального цилиндра) на нижней стороне горизонтально расположенного при гравистимуляции корня. В вертикально ориентированных корнях такой градиент не был выявлен. При использовании неиммунной сыворотки окрашивания срезов не наблюдали (рис. 1а), что свидетельствует о специфичности использованного нами иммуногистохимического метода, который позволяет по интенсивности окрашивания оценить количество ауксинов в клетках. Определение количества ауксинов раздельно в верхних и нижних частях (половинках) отрезков корней с помощью метода с усилением сигнала показало их большее накопление в нижней части (1.3 ± 0.3 нг) по сравнению с верхней (0.1 ± 0.02 нг).
Через 24 ч после удаления придаточных корней у проростков пшеницы увеличивалось количество примордиев и боковых корней, как в расчете на единицу длины, так и на весь оставшийся главный корень по сравнению с интактными растениями, которые использовали в качестве контроля (табл. 1 и 2). Содержание ауксинов в главном корне, которое определяли с помощью стандартного иммуноферментного метода [16], возрастало по сравнению с контролем (табл. 2). Наибольшее различие проявлялось через 24 ч (в 3 раза по сравнению с контролем). Иммунное окрашивание срезов зоны образования боковых корней с помощью антител к ИУК показало повышенный уровень содержания ауксинов в клетках примордиев и центрального цилиндра (рис. 26). При использовании неиммунной сыворотки первичные стенки клеток в области примордиев не окрашивались, что подтверждает специфичность окрашивания при использовании специфических антител (рис 2 а). Слабое почернение клеточных стенок более зрелых клеток коры и центрального цилиндра, которое наблюдали и без окрашивания (фотографии не приводятся), вероятно, было сле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.