научная статья по теме ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ БИОЧИПЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА Биология

Текст научной статьи на тему «ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ БИОЧИПЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 267-276

УДК 57.083.3

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ БИОЧИПЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

© 2008 г. А. В. Шишкин1' 2*, И. И. Шмырев1, С. А. Кузнецова1, Н. Г. Овчинина1' 2, А. А. Бутылин1, 3, Ф. И. Атауллаханов1, 3' 4, А. И. Воробьев1

1 ГУ Гематологический научный центр РАМН, 125167 Москва, Новозыковский проезд, 4а;

факс (495) 612-4252; электронная почта: shishkin_lab@mail.ru

2 Ижевская государственная медицинская академия, 426034 Ижевск, ул. Коммунаров, 281;

факс: 8-(3412) 65-81-67

3 Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва ГСП-1, Ленинские горы; факс: (495) 939-01-26 4 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, 117977 Москва ГСП-1, ул. Косыгина, 4

Поступила в редакцию 06.04.2008 г.

Описаны иммунологические биочипы для определения поверхностных антигенов эритроцитов, относящихся к системам АВ0 и Rh (D, E, e, C, c). Биочипы представляют собой прозрачные пластиковые подложки, на которые нанесены пятна (диаметром 1.5 мм) иммобилизированных антител IgM, специфичных к соответствующим антигенам. Для проведения анализа с помощью этих биочипов достаточно 1-2 мкл крови. Показано избирательное связывание эритроцитов с иммобилизирован-ными на биочипе антителами, и продемонстрирована возможность морфологического исследования связавшихся клеток. С помощью проточной камеры исследована зависимость отрыва связанных с антителами эритроцитов от сдвиговой скорости потока при отмывке биочипа. Показано, что в сочетании с проточной камерой биочип может быть использован для концентрирования клеток, имеющих те или иные антигены, из смешанной суспензии, даже если их содержание в смеси невелико.

Белковые микроматрицы (биочипы) все более широко используются как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Их основным достоинством является возможность одновременного проведения множества однотипных реакций, причем для этого достаточно небольшого объема исследуемого материала [1].

Белковый биочип представляет собой твердую поверхность (подложку) с иммобилизированными на ней в строго определенных участках белками, которые способны специфически связывать молекулы, присутствующие в образце [2].

В качестве подложек для белковых биочипов чаще всего используют нитроцеллюлозу и химически модифицированное стекло [1, 3, 4], реже золото [5, 6], полистирол [7] или тефлон [8].

Один из наиболее распространенных видов белковых микроматриц - биочипы с иммобилизированными антителами. Такие биочипы могут быть использованы для одновременного обнаружения большого числа антигенов [9].

Чанг [10] впервые продемонстрировал связывание клеток на биочипе с иммобилизированными антителами, специфичными к поверхностным антигенам. В последние годы подобные биочипы созданы несколькими группами исследователей [5, 11-18].

* Автор для переписки.

Большинство этих работ посвящено созданию биочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов лейкоцитов [11-17]. Однако в некоторых работах с помощью биочипов изучена возможность иммунофенотипирования эритроцитов. Квин и соавт. [19] впервые показали связывание эритроцитов на биочипе с антителами, специфичными к их поверхностным антигенам. Созданы биочипы для определения поверхностных антигенов, относящихся к системам АВ0 [18] и И! [5, 18].

Большинство методов определения поверхностных антигенов эритроцитов основано на их способности к агглютинации при добавлении антител [20]. Помимо агглютинации в объеме используется агглютинация на твердой подложке [21, 22] и в геле [23]. Преимущество иммунофенотипирования эритроцитов с помощью биочипа перед упомянутыми выше методами состоит в возможности одновременного анализа присутствия антигенов системы АВ0 и системы ИИ (С, с, Е, е). При этом значительно снижается расход антител и становится возможным использование меньшего количества биологического материала.

Тем не менее подобные биочипы предназначены скорее для исследовательских целей (определения закономерностей взаимодействия клеток с антителами, иммобилизированными на твердой поверхности), чем для практического использования

в диагностических целях. Эритроциты являются очень удобной биологической моделью, поскольку их значительно проще выделять из крови, чем клетки других типов, а количество молекул различных антигенов на их поверхности хорошо изучено [24].

При работе с описанными выше биочипами неспецифически связавшиеся клетки отмывали, ополаскивая биочипы буферным раствором. Лишь в работе [17] с помощью проточной камеры исследовали зависимость количества лимфоцитов, связавшихся на твердой подложке с иммобилизирован-ными антителами, от тангенциального сдвигового напряжения.

Использование непрозрачных подложек при изготовлении большинства описанных биочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов, не позволяло проводить морфологическое исследование связавшихся клеток. В то же время иммунофенотипирование и морфологическое исследование клеток являются важнейшими методами в диагностике гематологических заболеваний. Поэтому создание биочипа, позволяющего совместить определение поверхностных антигенов с последующей окраской и морфологическим исследованием клеток, весьма актуально. Это совмещение может стать особенно полезным, например, при анализе клеток лимфоидных и миелоидных опухолей. В данном случае при работе с эритроцитами мы хотим лишь продемонстрировать такую возможность.

Задачей работы было создание биочипа для им-мунофенотипирования эритроцитов человека по поверхностным антигенам групп АВО и Rh (D, E, e, C, c), позволяющего проводить морфологическое исследование связавшихся на биочипе клеток, а также определение зависимости плотности заполнения клетками поверхности пятен биочипа от скорости потока жидкости при отмывке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Мышиные моноклональные антитела (IgM) анти-A, анти-B, анти-D, анти-C, анти-E, анти-c и анти-e (диагностикумы марки ЦОЛИК-ЛОН™, ООО "Гематолог", Россия) использовали без дополнительной очистки. В работе использовали также обезжиренное сухое молоко ("Kroger", США), раствор для градиентного центрифугирования Ficoll-paque, EDTA, фосфатный буфер (PBS) рН 7.4, 0.05% раствор Tween-20, метанол (все "Sigma Aldrich", США).

Изготовление биочипов. В качестве подложек для изготовления биочипов использовали пластиковые покровные стекла ("Fisher Scientific", США).

Капли растворов (0.5 мкл) с различным разведением антител наносили на подложки автомати-

ческой пипеткой в заранее отмеченные участки. Затем биочипы помещали в емкость, где поддерживалась 100% влажность воздуха, и инкубировали при +4°С в течение ночи, после чего высушивали на воздухе и замораживали при -26°С в герметичных контейнерах с осушителем (силикагель). При таком хранении биочипы не теряли своих свойств по меньшей мере в течение 12 месяцев.

Для экспериментов с использованием проточной камеры были изготовлены биочипы, на подложки которых наносили капли растворов антител одного вида в разведении от 1 до 1/32 и располагали в один ряд. Такие биочипы имели по шесть пятен.

Для экспериментов, проводившихся без использования проточной камеры, были изготовлены биочипы, где капли растворов с различными разведениями антител (анти-А, анти-В, анти-D (1/41/256), анти-с, анти-С, анти-е и анти-Е (1-1/256)) наносили рядами на одну и ту же подложку. Такие биочипы имели по 57 пятен.

Связывание эритроцитов на биочипах. Биочипы закрепляли в чашках Петри, ополаскивали 1% раствором обезжиренного сухого молока в PBS, затем сразу же отмывали 3 раза 0.05% раствором Tween-20. После этого вновь заполняли чашки 1% раствором обезжиренного сухого молока в PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со слабым перемешиванием на шейкере. Затем биочипы отмывали 3 раза 0.05% раствором Tween-20 и ополаскивали PBS для удаления следов детергента. После этого биочипы инкубировали с суспензией эритроцитов в PBS при комнатной температуре. Концентрацию эритроцитов и объем суспензии подбирали так, чтобы при полном оседании клеток на дне чашки образовался их монослой. (Оптимально 2.5 мл суспензии с концентрацией 5.5 х 106 клеток/мл при использовании чашек Петри диаметром 35 мм.) Для проведения анализа требовалось 1-2 мкл крови.

В части экспериментов для отмывки от неспецифически связавшихся клеток биочипы несколько раз ополаскивали PBS. Качество отмывки оценивали при помощи инвертированного микроскопа: вне пятен биочипа (областей с нанесенными антителами) клетки должны были отсутствовать. Биочипы высушивали на воздухе.

В ряде экспериментов инкубацию с клетками и отмывку биочипов осуществляли в проточной камере.

В работе использовали как отмытые эритроциты, полученные из гепаринизированной периферической крови, так и цельную кровь. Предварительные эксперименты не выявили при этом каких-либо отличий.

Морфологическое исследование связавшихся клеток. Связавшиеся на биочипе клетки фиксировали метанолом в течение 8 мин и окрашивали по

Рис. 1. Чертеж проточной камеры. 1 - Корпус камеры, 2 - стекло, 3 - биочип, 4 - приводящая трубка, 5 - отводящая трубка, 6 - кран, 7 - трубка для дополнительного введения жидкости в капилляр камеры. Общая длина канала проточной камеры 33 мм, ширина 6 мм, глубина 1.3 мм. Внутренний диаметр приводящей и отводящих трубок 3 мм. Расстояние между краями отверстий трубок 21 мм.

Романовскому-Гимзе, после чего биочип промывали водой и высушивали. Затем биочипы извлекали из чашек Петри, наклеивали на предметные стекла и осуществляли морфологическое исследование связавшихся клеток.

Оценка плотности связывания клеток в области пятен биочипа. Каждое пятно биочипа фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата "Olimpus SP-350", смонтированного на микроскопе "OPTON" ("OPTON", Германия). Для определения плотности связывания клеток на поверхности пятен биочипа на каждой микрофотографии выбирали участки 100 х 100 мкм и подсчитывали клетки не менее чем в трех участках: в центре пятна, на краю пятна и между ними. Полученные при этом значения плотности связыв

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком