ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 356-364
УДК 581.1
ИММУНОЛОКАЛИЗАЦИЯ PIP-АКВАПОРИНОВ В ПРОТОПЛАСТАХ ИЗ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ МЕЗОФИЛЛА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ В ИЗООСМОТИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ И ПРИ ОСМОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ
© 2007 г. Т. А. Шевырева, И. М. Жесткова, М. С. Трофимова
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 31.10.2006 г.
У протопластов из клеток суспензионной культуры мезофилла сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) в ответ на кратковременный осмотический стресс обнаружены изменения объема. При 1.5-кратном увеличении (от 0.4 до 0.6 М) или уменьшении (от 0.4 до 0.25 М) концентрации сорбита в наружной среде объем протопластов, соответственно, уменьшался или увеличивался на 55-60%. Эти изменения начинались сразу после изменения концентрации осмотика в среде и заканчивались через 1-3 мин. Интенсивность флуоресценции маркера эндоцитоза FM 1-43 при смене изотонической среды на гипотоническую заметно возрастала, но не менялась при смене на гипертоническую среду. Вместе с тем, при этом наблюдали скопление флуоресцирующего материала в периплазматическом пространстве. Вестерн-блот-анализ с использованием иммунной сыворотки к консервативной последовательности аквапоринов PIP-типа выявил их наличие как в плазмалемме, так и во внутриклеточных мембранах. Подтверждением этому служат и данные, полученные методом непрямой имму-нофлуоресцентной микроскопии: между плазмалеммой и внутренним компартментом протопласта обнаружено относительно равномерное распределение флуоресцирующего окрашивания, обусловленного связыванием с мембранами меченых Alexa 488 вторичных антител. На полученных микрофотографиях протопластов после гипотонического воздействия заметен их переход в набухшее состояние и равномерное, но менее интенсивное, в сравнении с изотоническими условиями, свечение поверхности плазмалеммы. После гипертонического воздействия наряду со сжатием протопластов наблюдали гетерогенное распределение окрашенных и светлых участков плазмалеммы, причем яркость окрашенных участков была очень высокой. Полученные результаты интерпретируются как подтверждение активации экзо- и эндоцитоза при кратковременном действии осмотического стресса. Мигрирующие участки плазмалеммы обеднены аквапоринами PIP-типа, следовательно, при индуцировании осмотического стресса содержание аквапоринов этого типа в плазматической мембране не меняется.
Beta vulgaris - протопласты - осмотический стресс - FM1-43 - везикулярный транспорт -PIP-аквапорины
ВВЕДЕНИЕ
Условия для возникновения осмотического стресса в растениях формируются одновременно с началом действия таких абиотических стрессов как засуха, засоление, низкая температура и др. Неизбежность осмотического стресса при этом обусловлена изменением направления и величины градиента водного потенциала, а в результате - повышением вероятности возникновения водного дефицита, снижением тургорного давления и объема клеток [1]. Сохранение необходи-
Адрес для корреспонденции: Трофимова Марина Сергеевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: troms@ippras.ru
мого для жизни градиента водного потенциала по отношению к почвенному раствору и воздушной среде в значительной мере определяется разнообразием и эффективностью механизмов осморегуляции на клеточном уровне. Клеточная осморегуляция должна включать в себя оптимизацию интенсивности трансмембранных потоков ионов и воды, синтез совместимых осмо-литов в цитозоле, модификацию компонентного состава клеточных стенок, модуляцию активности системы внутриклеточного везикулярного транспорта [2-5].
В последнее время особое значение в системе адаптивных механизмов растений придается ак-вапоринам - мембранным белкам с функцией водных каналов [6-8]. Представление об аквапо-ринах как одном из важнейших пунктов в системе
адаптивных механизмов основано, прежде всего, на особенностях их молекулярной организации, дающей широкие возможности для регулирования их функциональной активности [8, 9]. Кроме того, может изменяться и содержание этих белков в мембране, что еще больше расширяет диапазон их регуляторных возможностей [10]. Совокупность регуляторных механизмов позволяет эффективно контролировать интенсивность ак-вапорин-опосредованной компоненты трансмембранного водного транспорта и полностью или в максимально возможной степени обеспечивать потребности клеток в воде при всех изменениях внешних условий.
В настоящее время вопрос о способах регулирования количества аквапоринов в мембранах растений при оптимальных и стрессовых условиях исследован мало. Однако полученная информация указывает, по крайней мере, на два таких способа - через регуляцию транскрипции генов аквапоринов и за счет перераспределения мембранного материала с участием везикулярного транспорта. Так, показано, что экспрессия генов аквапоринов растений крайне чувствительна к действию неблагоприятных факторов внешней среды, что выражается в ее активации или подавлении, и предполагается, что это приводит к таким же изменениям в осмотической водной проводимости мембран [8, 10].
На примере клеток почечных канальцев показано, что осмотическая водная проницаемость апикальной мембраны меняется в широких пределах в результате вазопрессин-индуцируемого встраивания в нее AQP2-содержащиx везикул [11], что предполагает возможность регуляции содержания аквапоринов в мембранах, действующей на уровне системы везикулярного транспорта. Эта информация послужила поводом для аналогичных исследований на растениях. Результаты, полученные Vera-Estrella с соавт. [12], показали, что после нескольких часов инкубации клеток Mesembreanthemum crystallinum in vitro в гипертонической среде происходило чувствительное к ингибиторам везикулярного транспорта перераспределение аквапорина TIP 1;2 (McMIPF) из то-нопласта в мелкие внутриклеточные везикулы. Кроме того, в клетках корней Arabidopsis в условиях засоления наблюдали появление внутриклеточных структур, содержавших PIP1;2- и PIP2; 1-аквапорины [13].
Между тем известно, что при резком отклонении среды от изотонических условий очень быстро (в минутном диапазоне) изменяется площадь поверхности и объем протопластов [14-16]. В аналогичном временном диапазоне должна происходить и активация везикулярного транспорта, чтобы обеспечить эти изменения: при набухании протопластов за счет встраивания, а при сжатии
за счет интернализации мембранного материала плазмалеммы [17-19]. В составе везикул, транспортируемых к плазмалемме или от нее, могут содержаться аквапорины PIP-типа в активном или неактивном состоянии. Поэтому целью настоящей работы было выявление изменений в содержании аквапоринов при кратковременном действии осмотического стресса и их перераспределения между плазмалеммой и эндомембранами с участием везикулярного транспорта. При быстрой смене осмотического потенциала среды мы надеялись исключить вероятность активации экспрессии генов аквапоринов, поскольку для этого, согласно литературным данным, необходимо воздействие осмотика, длящееся не менее часа [12, 13, 20]. Использование в качестве модельной системы протопластов, а не клеток, позволило нам более точно регистрировать изменения их объема и обеспечило доступность плазмалеммы для взаимодействия с маркерами и ингибиторами везикулярного транспорта.
МЕТОДИКА
Выделение протопластов. Протопласты выделяли из клеток 14-дневной суспензионной культуры мезофилла сахарной свеклы (Beta vulgsris L.) из коллекции Института физиологии растений РАН. Клетки трижды отмывали в среде, содержавшей 20 мМ аскорбат калия и 2 мМ CaSO4, рН 5.4. Затем их инкубировали при постоянном перемешивании в той же среде, содержавшей ферменты (вес/объем): 0.4% дрейселазы, 0.2% целлюлазы Onozyka R-10, 0.1% мацерозима, 0.1% целлюлизина, и 0.4 М сорбита, при температуре 25°С в течение 90 мин. После фильтрации суспензии через тканевой фильтр Miracloth ("Calbio-chem", США) протопласты трижды отмывали от раствора ферментов центрифугированием (100 g, 10 мин), используя среду суспендирования, содержавшую 0.4 М сорбит, 1 мМ CaSO4, 2.5 мМ K2SO4, 20 мМ Mes-КОН-буфер, рН 6.5. Отмытые протопласты суспендировали в той же среде до концентрации 2 х 106 клеток/мл и использовали для последующих экспериментов.
Кинетика изменений объема протопластов.
Скорость изменения объема протопластов при осмотическом стрессе оценивали, регистрируя кинетику изменений оптической плотности суспензии в условиях снижения/увеличения осмоляр-ности среды. Измерения проводили при X = = 600 нм в двухлучевом режиме на спектрофотометре Hitachi 557 ("Hitachi", Япония). Для достижения гипер- (0.6 М сорбит) или гипоосмотиче-ских (0.25 М сорбит) условий к суспензии протопластов, находившихся в измерительной кювете в изоосмотических условиях (0.4 М сорбит), добавляли равный объем среды суспендирования, содержавшей 0.8 или 0.1 М сорбит соответственно.
Одновременно в кювету сравнения, содержавшую суспензию в исходной среде, вносили тот же объем буфера с 0.4 М сорбитом. Конечная концентрация протопластов в кюветах оказывалась равной 106 клеток/мл. Процедура смешивания занимала обычно не более 20 с. Далее измерения проводили в течение следующих 5 мин без перемешивания. Оседание протопластов в кюветах за это время было незначительным. Чтобы показать, что изменения оптической плотности суспензии протопластов отражают изменения их объема при сжатии или набухании, измеряли диаметры не менее, чем 200 протопластов на полученных под микроскопом фотографиях и рассчитывали объем, принимая, что протопласт имеет форму сферы.
Оценка активности везикулярного транспорта по измерению интенсивности флуоресценции FM 1-43. Об участии везикулярного транспорта в изменении площади поверхности плазмалеммы при осмотическом стрессе судили по интенсивности флуоресценции маркера эндо-и экзоцитоза FM 1-43 ("Molecular probes", США), индуцируемой при связывании этого красителя с липидным матриксом мембран [21, 22]. Интенсивность флуоресценции красителя и кинетику ее изменений измеряли на флуоресцентном спект
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.