КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2013, том 58, № 2, с. 261-267
СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
УДК 548.737 + 577.15 + 577.32 + 615.2
Посвящается памяти Б.К. Вайнштейна IN SILICO АНАЛИЗ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ ГОМОДИМЕРА УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS В НЕЛИГАНДИРОВАННОМ СОСТОЯНИИ И ЕЕ КОМПЛЕКСА
С 5-ФТОРУРАЦИЛ ОМ
© 2013 г. А. А. Лашков, С. Е. Сотниченко, А. М. Михайлов
Институт кристаллографии РАН, Москва E-mail: alashkov83@gmail.com Поступила в редакцию 06.08.2012 г.
Псевдотуберкулез — острое инфекционное заболевание, характеризующееся поражением желудочно-кишечного тракта. Селективно подавляя активность уридинфосфорилазы возбудителя заболевания Yersinia pseudotuberculosis, можно добиться положительного терапевтического эффекта. В литературе описана синергия действия химиотерапевтического препарата 5-фторурацила и противо-микробных препаратов, блокирующих синтез пиримидиновых оснований, на клетки патогенных простейших и бактерий. Отсутствие трехмерной структуры уридинфосфорилазы из Yersinia pseudotuberculosis (YptUPh) как в нелигандированном состоянии, так и ее комплексов с фармакологическими препаратами затрудняет поиск и конструирование селективных ингибиторов YptUPh. Методом молекулярного моделирования по гомологии определена пространственная структура гомоди-мера YptUPh в нелигандированном состоянии. Трехмерная структура субъединицы молекулы YptUPh относится к классу а/Р-белков с архитектурой трехслойного а/Р/а-сэндвича. Мономер субъединицы молекулы YptUPh состоит на 38% из спиралей и на 24% из Р-лент. Методом молекулярного докинга получена модель структуры гомодимера комплекса YptUPh с 5-FUra. Положение 5-FUra в активном центре молекулы хорошо согласуется с известными данными по другим бактериальным уридинфосфорилазам, полученными методом рентгеноструктурного анализа (комплекс уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (StUPh) c 5-FUra, ID PDB: 4E1V; комплекс уридинфосфорилазы из Escherichia coli (EcUPh) с 5-FUra и рибозо-1-фосфатом, ID PDB: 1RXC).
DOI: 10.7868/S002347611302015X
ВВЕДЕНИЕ
Псевдотуберкулез — острое зоонозное инфекционное заболевание, характеризующееся поражением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в сочетании с разнообразной токсико-аллергиче-ской и полиочаговой симптоматикой. Возбудитель псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) открыт L.-Ch. Malasse и W. Vignal в 1888 г. В клинических проявлениях иерсиниозов (включая псевдотуберкулез) обычно наблюдают сочетание нескольких синдромов. Селективно подавляя активность важных для жизнедеятельности ферментов бактерии, в частности Yersinia pseudotuberculosis, можно добиться положительного терапевтического эффекта. Одним из таких ферментов является уридинфосфорилаза (UPh; E.C. 2.4.2.3), осуществляющая катализ реакции фосфорилиро-вания пиримидиновых нуклеотидов [1—4].
В исследованиях [5—7] показана синергия действия химио-терапевтического препарата 5-фто-рурацила (5-FUra) и противомикробных препаратов, блокирующих синтез пиримидиновых основа-
ний, на клетки злокачественных новообразований высших организмов, клетки патогенных простейших и бактерий. Синергия в данном случае является следствием подобия механизмов действия указанных выше препаратов.
Отсутствие трехмерной структуры уридинфос-форилазы из Yersinia pseudotuberculosis как в нели-гандированном состоянии, так и ее комплексов с фармакологическими препаратами затрудняет понимание структурно-функционального механизма перспективных методов лечения псевдотуберкулеза с помощью селективных ингибиторов энзима YptUPh.
Однако высокая гомология первичных структур бактериальных уридинфосфомсфорилаз, для которых трехмерная атомная структура известна, с YptUPh (рис. 1) позволяет воссоздать пространственную структуру YptUPh как в нелигандиро-ванном состоянии, так и ее комплексов с лиган-дами методами молекулярного моделирования по гомологии.
10 20 30 40 50 60 70 80
.... | .... | .... | .... I ....| .... | .... | .... |----| .... | .... | .... 1----| ....|.... | .... 1 .... |
L1 --H1-- S1 ----H2------S2---L2--S3-- L3 -S4 L4 H3------
StUph 1 .^кГ^-ч^ьг^к^ссл!;^
L1 ---H1— S1 L2 -----H2---- L3 ------S2------L4 ------H3-------
VchUph 1 :.':v:"a:.:.М'.;.■•.:■ : r к;:;vgl-: : :.v: Ni'w:kah.:.: :: :: r; : ay:-:- :.., .■ :
L1 --S1 H1--------- L2 --S2 L3 -S3 L4 ------H2------
90 100 110 120 130 140 150 160 170
.... I----I .... I .... I .... I .... I .... I .... I----I .... I .... I----I .... I .... I .... I----1 .... I
----S5---- L5 ---S6 --H4 L6 H5 _ ""S7 L7 H6
StUph 86 pRTFT-R T^TTC-ATQF;! I А^У^Т.Г: A^ Т.] [F AP ^F ? A AJ^ F-AAK.^^
----S3---- L5 —"S4 ---H4--- L6 H5 _ -Z-=S5--------L7
VchUph 86 Jp.TF I-FVoT'lGA LCIPHVNVoLj^I V"' T V К L!; Ü A S1. -i F ЛР KE F ¡' A V FIX IjSJJt А^АЛЛ S А гД 1: T TT Л О О L'. Т F Y о QE К Y j
----S4----- L5 ----S5 ---H3- - L6 -------H4 ----S6--------L7
YptUph 86
180 190 200 210 220 230 240 250
. ... | .... | .... | .... | .... |----I . I----I I I----1----I I I----I . . .
L8 ------H7 -S8 -----H8----------S9 L9 --------H9
StUph 171
VchUph 171
H5 -S7 = = = = =H6== = ======S8~-=== L8 H7
YptUph 171
Рис. 1. Выравнивание первичных последовательностей 5ШРЬ, YpiUPh и РсЛиРЬ. Гомология между ¿ЮТИ и YptUPh — 92.9 % (235 а.о.), между РСиРИ и YptUPh — 76.7% (194 а.о.). Идентичные а.о. не выделены; гомологичные выделены серым цветом; негомологичные — инверсией. ¿¡, Н, Ь — Р-лента, спираль, петля соответственно, I — порядковый номер структурного элемента.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Молекулярное моделирование гомодимера YptUPh.
Исходной моделью для построения трехмерной структуры гомодимера YptUPh в нелигандиро-ванном состоянии в качестве опорной структуры выбрана структура уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium (StUPh) (опорная структура; ID PDB: 3DPS), так как гомология аминокислотных последовательностей между StUPh и YptUPh (рис. 1) наиболее высокая среди бактериальных уридинфосфорилаз [8]. А именно, 92.9% аминокислотных остатков (а.о.), образующих трехмерную структуру субъединиц StUPh и YptUPh, идентичны; 4.7% а.о. — аналогичны и только 2.4% а.о. — различаются (рис. 1). Выравнивание аминокислотных последовательностей (рис. 1) проведено опцией "align2d" программы Modeller 9v8 [9—12].
Молекулярное моделирование пространственной структуры гомодимера YptUPh по гомологии проведено с помощью подпрограммы "automodel" программы Modeller 9v8. Возможные конформеры пространственной структуры гомо-димера YptUPh установлены с помощью подпрограммы "automodel" программы Modeller 9v8. Параметры процедуры молекулярного моделирования по гомологии приведены в табл. 1.
Из списка предложенных решений выбран вариант с минимальным значением оценочной функции "Discrete optimized potential energy (DOPE)" Score [11]. Значение "DOPE Score" для структуры YptUPh составляет —27605.6.
Оптимизация геометрии структуры биомолекулы. В рентгеноструктурном анализе (РСА) для уточнения пространственной структуры биомак-ромолекулярного комплекса используется процедура минимизации свободной энергии биомолекулы [13, 14]. Аналогичная процедура является непременным условием и при решении структуры методом молекулярного моделирования по гомологии, т.е. проводится оптимизация геометрических параметров искомой модели на ее соответствие глобальному минимуму энергии.
Оптимизация геометрии полученных методами in silico моделей гомодимеров как нелиганди-рованной YpUPh, так и ее комплекса YpUPh с 5-FUra проведена в комплексе программ Gromacs [15] с использованием набора силовых полей GROMOS96. При оптимизации использовался вариант минимизации энергии (EM, табл. 1) с явно заданным растворителем. Для этого была выбрана ячейка в виде прямоугольного параллелепипеда со сторонами 76.02 х 81.68 х 78.14 А. Расстояние между поверхностью гомодимера энзима и гранями
ячейки составляло не менее 9 Ä. При моделировании структуры энзима использовали трехцентро-вую модель воды SPC216 [15]. Протокол оптимизации, использованный при выполнении работы, отработан на структуре молекулы комплекса ÄUPh с 5-FUra, определенной методом РСА (ID PDB: 3NSR). Значения основных параметров протокола оптимизации геометрии (EM) для YptUPh приведены в табл. 1.
Молекулярный докинг 5-FUra в нелигандиро-ванную структуру YptUPh. Поиск оптимальных решений встраивания лиганда 5-FUra в сайт связывания белка-мишени YptUPh проводился в соответствии с протоколом, отработанном на структуре комплекса ¿ÍUPh с 5-FUra (ID PDB: 3NSR), решенного методом РСА. Молекулярный докинг 5-FUra в область урацилсвязывающего сайта энзима YptUPh проведен программой AutoDock 4.2 в варианте генетического алгоритма [16].
Значения основных параметров протокола до-кинга приведены в табл. 1. По результатам РСА опорной структуры ÄUPh область урацилсвязывающего сайта может быть описана прямоугольным параллепипедом с длиной сторон 15.1 х х 16.4 х 13.6 Ä. На основании этих данных область связывания энзимом YptUPh лиганда 5-FUra выбрана в форме куба с длиной ребра 22.5 Á при 60-кратной дискретности.
Группа решений докинга объединялась в кластер, если значение r.m.s.d. координат атомов выявленных конформеров 5-FUra не превышало 1.5 Á. После проведения молекулярного докинга проводилась оптимизация геометрии гомодимера комплекса YptUPh + 5-FUra по протоколу, описанному выше (табл. 1).
Оценка достоверности структуры. Для оценки достоверности молекулярного моделирования проведено моделирование контрольной структуры урилинфосфорилазы из Vibrio cholerae (VchUPh) (ID PDB: 3O6V) с помощью программы Modeller 9v8 [9—12] по протоколу, описанному выше. Смоделированная контрольная структура VchUPh сравнивалась со структурой VchUPh, определенной методом РСА (ID PDB: 3O6V) c разрешением 1.7 Á. Сравнение проводилось в программе SSM [17] системного пакета CCP4 [18]. Визуальное сравнение структур проводилось в программе COOT [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Первичная структура. Полипептид субъединицы гомодимера YptUPh (рис. 1) состоит из 253 а.о. Молекулярная масса субъединицы YptUPh равна 27.5 kDa [8]. Гомология первичных структур YptUPh и ¿YUPh составляет 92.9%, а YptUPh и Vch UPh
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.