БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.6, с. 1108-1116
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 576.32/.36
ИНСУЛИНОПОДОБНЫЙ ФАКТОР РОСТА 1 И КЛЮЧЕВЫЕ МАРКЕРЫ ПРОТЕОЛИЗА В ОСТРОМ ПЕРИОДЕ РЕАДАПТАЦИИ ПОСТУРАЛЬНОЙ МЫШЦЫ, АТР ОФИР ОВАННОЙ В РЕЗУЛЬТАТЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РАЗГРУЗКИ
© 2010 г. Е.В. Качаева, О.В. Туртикова, Т.А. Лейнсоо, Б.С. Шенкман
ГНЦ РФИнститут медико-биологических проблем РАН, 123007, Москва, Xорошевское шоссе, 76а
Поступила в p едакцию 23.06.10 г.
Показано, что накопление мышечной массы и восстановление объема волокон камбаловидной мышцы, атрофир ованной в p езультате p азгрузки, в первую неделю происходит пр еимущест-венно за счет накопления воды, а не активации синтеза белка. Уровень экспр ессии основных маркеров активности убиквитин-протеасомной системы остается высоким на третьи сутки восстановления, снижаясь лишь к концу первой недели. Установлено, что возрастание количества мРНК инсулиноподобного фактора роста 1, числа клеток-сателлитов, слившихся с мышечными волокнами, а также числа миоядер в волокнах камбаловидной мышцы начинается лишь на седьмые сутки восстановительного периода. Полученные данные свидетельствуют о значительной инертности постуральных мышц при адаптации их к нагрузке после длительной функциональной р азгрузки.
Ключевые слова: скелетная мышца, атрофия, восстановление, протеолиз, сигнальные системы.
Атрофия скелетных мышц, наблюдаемая пр и функциональной р азгрузке, оказывается наиболее выраженной в постур альных мышцах, например, в камбаловидной мышце голени, что обычно связывают с устранением позно-тони-ческой функции в условиях безопорной среды [1]. Разгрузка скелетных мышц приводит к глубоким структурно-функциональным изменениям как на уровне целой мышцы, так и на молекулярном уровне. Мышечная атрофия выражается, главным образом, в потере мышечной массы, обусловленной уменьшением размер ов мышечных волокон [2,3]. К роме того, функциональная разгрузка вызывает сдвиг паттер на экспр ессии тяжелых цепей миозина (ТЦМ) в сторону преимущественного образования быстрых волокон [4-6], а также способствует снижению числа миоядер и сателлитных клеток [7,8]. Атрофия миофибрилл в условиях гипокинезии или гипо гравитации приводит к снижению функциональных способностей мышцы, а именно к ухудшению сократительных свойств [9-11]. В настоящее время атрофию рассматривают как результат смещения баланса синтеза белка и его протеолитического распада в направлении преимущественной активации протеолиза [12].
Сокращения: ТЦМ - тяжелые цепи миозина, УПС -убиквитин-протеасомная система, ПЦР - полимеразная цепная реакция, ГФДГ - глицерофосфатдегидрогеназа, ППС - площадь поперечного сечения.
П ри этом снижение числа миоядер, показанное ранее [7,8], свидетельствует не только о снижении интенсивности белкового синтеза, но и о сокращении числа матриц для синтеза белка.
В развитии атр офии скелетных мышц в условиях функциональной разгр узки пр инимают участие несколько ключевых систем протеолиза: Са2+-зависимая (кальпаины), лизосомная и уби-квитин-пр отеасомная (УП С) системы. Лизосомная система не играет существенной роли в пр отеолизе при функциональной разгр узке [13], тогда как кальпаины и УПС вносят основной вклад в распад белка при атр офии в условиях гипокинезии или гипогравитации [14-17]. Интер есно, что пр и антиорто статическом вывешивании грызунов скорость синтеза белка в мышцах задних конечностей существенно снижается (до 21% на 14-е сутки воздействия) [18], также уменьшается активность протеинкиназы В (РКВ) и шТОИ-системы [19]. Два последних из упомянутых факторов, как известно, являются звеньями сигнальных каскадов, регулирующих интенсивность белкового синтеза. Оба фактора активируются при повышении концентрации ин-сулиноподобного фактора роста 1 (ЮР-1) [20].
В литературных источниках имеются данные о восстановлении мышечной массы, площади поперечного сечения быстрых и медленных волокон через семь дней после прекр аще-ния вывешивания (см., например, [21-23]), но
данных об изменении активности компонентов УПС очень мало. Стандартными маркерами, отражающими активность УП С, являются уби-квитин-лигазы МАРЪх/атрогин-1, МиИР-1 [24,25]. В условиях функциональной разгрузки количество убиквитин-лигаз и компонентов пр отеасом возрастает как на ур овне мРНК, так и на белковом уровне [13,19,26]. Поведение этих маркеров при восстановлении мышцы после разгрузки не изучалось.
Активация анаболических сигнальных путей (фосфорилирование р7086К) была обнаружена на ранних этапах р азгрузки (два-три дня) [27]. В то же вр емя содержание ЮР-1 в кр ови оставалось сниженным в течение 7 сут восстановления, после чего оно возрастало в пять раз [28]. Согласно этим данным, восстановление мышечной массы может отчасти объясняться повышением содер жания ЮР-1 в крови не р ань-ше, чем через неделю после начала восстановления. Известно, что ЮР-1 стимулирует пролиферацию и слияние с материнским волокном клеток-сателлитов [29]. Существенный вклад клеток-сателлитов в увеличение массы взрослого мышечного волокна был подтвержден также в исследованиях авторов работы [8] при облучении животных. Известно, что синтез ЮР-1 о существляется не только в печени, но и в мышце, а следовательно, на уровень активности ЮР-1-зависимых сигнальных систем, регулирующих синтез белка, могут оказывать влияние как ЮР-1 в крови, так и ЮР-1, образованный в мышце. В настоящее время нет данных об изменении уровня экспрессии этого фактора при восстановлении после длительной гипокинезии или гипогравитации.
Целью данной работы было определение изменения основных параметров, характеризующих интенсивность синтеза белка и его распада при восстановлении мышц, атрофированных в условиях продолжительной функциональной разгрузки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали крыс-самцов линии Вистар (242 ±3 г) содержавшихся в условиях вивар ия пр и свободном доступе к воде и корму. Перед началом эксперимента животных произвольным образом делили на четыре группы (п = 7): контроль (К), антиорто статическое вывешивание задних конечностей по стандартному методу [21] в течение 14 сут (Ы814), вывешивание с последующим восстановлением в стандартных условиях вивария в течение трех и семи суток, ЫБИЗ и Ы8И7. По окончании эксперимента животных наркотизировали пентобарбиталом
натрия (50 мг/кг), выделяли камбаловидную мышцу из обеих конечностей и замораживали в жидком азоте. Образцы хранили при температуре -85°С. Затем животным вводили летальную дозу пентобарбитала натрия (100 мг/кг). Все процедур ы с животными были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ ИМБП РАН.
Ядерный домен и повреждение дистрофино-вого слоя. Для определения числа ядер в волокнах камбаловидной мышцы, локализованных под сарколеммой, поперечные срезы толщиной 10 мкм окрашивали с использованием специфических антител на дистрофин (Santa-Cruz BioteAnology, США) [30], белок, образующий под сарколеммой сплошной слой. Для визуализации ядер после окраски антителами на дистр офин ср езы окрашивали DAPI (разведение 1:700), который добавляли к р аствору вторичных антител, конъюгированных с ФИТЦ (Santa-Cruz BioteAnology, США). Окрашенные ср езы инкубировали в фосфатном буфере (рН 7,2) и помещали в среду, стабилизирующую флуоресцентную метку Fluoromount G. Срезы анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа Leka Q500MC со встроенной цифровой фотокамерой (ТСМ 300F, Leka, Германия, 20х), с последующей их обработкой с помощью программного обеспечения Leka Qwin (Leka, Гер мания). Ядра, локализованные внутри волокна, окруженного дистрофиновой оболочкой, считали миоядрами. Рассчитывали число миоядер на одно волокно и площадь поперечного сечения на одно миоядро (рис. 1а). Определяли также количество разрывов дис-тр офинового слоя в одном волокне и процент волокон с разрывами от общего числа волокон на срезе, 40х (рис. 1б).
Анализ клеток-сателлитов. Для определения числа клеток-сателлитов поперечные срезы толщиной 10 мкм выдерживали пр и комнатной температуре 30 мин, после чего фиксировали 4%-м пар аформальдегидом в фосфатном буфер е (рН 7,2) в течение 15 мин. Затем ср езы промывали фосфатным буфером и обрабатывали 5% раствором сыворотки лошади (Novocastra, США), содержащим 1% тритона X-100 в течение 40 мин при комнатной температуре. Далее срезы инкубировали с моноклональными антителами козы на м-кадгерин (Santa Сг^ Biote^ hnology, США), растворенными в фосфатном буфере, содержащем 5% блокирующей сыворотки и 0,3% тритона X-100 при 4°С в течение 15 ч. Вторичные антитела кролика против IgG козы, конъюгированные с ФИТЦ, разводили в фосфатном буфер е (1:150), содержащем 5% блокирующей сыворотки и 0,1% тритона X-100.
Рис. 1. Иммуногистохимическое определение (на поперечном срезе камбаловидной мышцы): (а) -миоядер (показаны стрелками), 20х; (б) - разрывов дистрофинового слоя (показаны стрелкой), 40х; (в) -клеток-сателлитов (показаны стрелками; 20х.
Срезы инкубир овали в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего инкубировали с DAPI (разведение 1:700 в фосфатном буфере, рН 7,2) в течение 15 мин для выявления миоядер. Затем срезы промывали фосфатным буфером и покр ывали стабилизирующей флуоресцентную метку средой Fluoromount. Окрашенные ср езы анализировали с использованием флуор есцентного микр оскопа. Фотографии срезов анализировали с помощью программного обеспечения Leka Qwin (Leka, Германия). Подсчитывали число ядер клеток, окрашенных антителами на м-кадгер ин (клеток-сателлитов) на
одно волокно. Анализировали все волокна на срезах (рис. 1в).
Выделение тотальной РНК и реакция обратной транскрипции. Тотальную фракцию РНК выделяли из камбаловидной мышцы с помощью Qiagen RNeasy MiCTo kit (Qiagen GmbH, Германия) в соответствии с методикой, применяемой для тканей с большим количеством соединительно-тканных волокон с некоторыми модификациями. Для этого с образца замор ожен-ной мышцы (5-10 мг) делали ср езы с помощью криомикротома (Leka, Германия). Лизис проводили в течение 1 мин при интенсивном перемешивании. Для выделения РНК использовали микроколонки, после чего проводили элю-цию деионизованной водой без РНК
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.