= ГЕНЕТИКА
УДК 575.17
ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ЛЕОПАРДОВ (Panthera pardus orientalis) МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЧИСЛЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ
© 2013 г. В. В. Рожнов, П. А. Сорокин, В. С. Лукаревский, С. В. Найденко, Х. А. Эрнандес-Бланко, С. В. Лукаревский
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33
E-mail: sorokin-p@yandex.ru Поступила в редакцию 20.06.2012 г.
Впервые детально проанализирована генетическая структура популяции дальневосточного леопарда (Panthera pardus orientalis) в Юго-Западном Приморье. В 2010—2012 гг. были индивидуально определены 23 особи. Показано, что исследованные микросателлитные маркеры пригодны для индивидуального определения леопардов, мониторинга численности популяции и создания единой базы данных генетических профилей этого вида для решения исследовательских и природоохранных задач.
DOI: 10.7868/S0002332913020124
Дальневосточный леопард (Panthera pardus orientalis Schlegel, 1875) населяет крайнюю северную часть видового ареала. В прошлом область его распространения охватывала юг российского Дальнего Востока, горно-лесные территории Северо-Восточного Китая и Корейский п-ов. К началу ХХ в. в России дальневосточный леопард встречался на территории Приморского и Хабаровского краев (Гептнер, Слудский, 1972; Пику-нов, Коркишко, 1992). В настоящее время сохранился лишь один район, где он достоверно обитает — крайний юго-запад Приморского края, ограниченный на западе государственной границей с КНР, на севере и востоке р. Раздольной, на востоке и юге побережьем Японского моря.
Численность дальневосточного леопарда крайне мала. В середине 1970-х гг. в Приморье насчитывалось 38—46 леопардов (Абрамов, Пику-нов, 1974). В последующие годы леопарды сохранились только на одном участке ареала — в Юго-Западном Приморье, где их численность сохраняет относительную стабильность. По данным учетов по следам в 1983—1984 гг. на этой территории отмечено 25—30 особей (Пикунов, Коркишко, 1985), в 1990-1991 гг. - 33-36 (Абрамов и др., 1994), в 1997 г. - 25-31 (Пикунов и др., 2009), в 1998 г. - 40 (Арамилев, Фоменко, 2000), в 2000 г. -22-28, в 2003 г. - 28-30, в 2007 г. - 25-34 (Пикунов, 2010). Данные учета с помощью фотоловушек на одном из участков ареала показали, что численность леопардов в 2003-2008 гг. не менялась и составила от 18 до 21 особи (Арамилев и др., 2010).
Таким образом, современный ареал дальневосточного леопарда охватывает только ограниченный горно-лесной район площадью около 10—15 тыс. км2 на стыке трех государств — КНР, КНДР и России. По самым оптимистическим оценкам численность всей мировой популяции дальневосточного леопарда не превышает 40—52 особей (Ян Шихэ и др., 1998). В такой ситуации особенно важно постоянное слежение за состоянием и численностью последней в России популяции уникального хищника, в том числе с помощью неинвазивных методик с применением анализа ДНК, выделенной из экскрементов.
Современные методики индивидуальной идентификации животных, основанные на анализе ДНК, имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционным троплением в снежный период. Половозрастные отличия отпечатков лап у леопардов существенны. Однако наиболее частые ошибки во время тропления по снегу при идентификации той или иной особи возникают, когда встречаются следы молодых самцов и взрослых самок. Кроме того, ошибка возможна при идентификации разных индивидуумов одного пола в районах перекрывания или соприкосновения их участков обитания, либо при наличии обитающих на этой территории особей рыси и тигра. Таким образом, точность проводимых учетов напрямую зависит от квалификации учетчика. Индивидуальная идентификация животных возможна также с помощью кинологического метода, который тоже имеет ряд ограничений и требует наличия специально обученных собак (Сулимов, Кру-това, 1990).
Молекулярно-генетические методы уже применялись для оценки численности крупных кошек — амурского тигра (Sugimoto et al., 2012) и дальневосточного леопарда в Юго-Западном Приморье (Sugimoto, 2010). Однако для детального изучения популяционной структуры и разработки эффективных мер охраны дальневосточного леопарда этих данных не достаточно. Из-за отсутствия в этих публикациях частот встречаемости исследованных микросателлитных аллелей невозможно индивидуальное распознавание, выяснение возможных родственных связей животных, а также проведение молекулярно-биологической экспертизы по запросу судебных органов в случае гибели леопардов в результате браконьерства. В данном исследовании нами начата работа по поиску изменчивых микросателлитных локусов, пригодных для решения перечисленных задач, и созданию единой базы данных по всем индивидуально определенным животным.
Молекулярно-генетические методики позволяют точно индивидуально различать животных, но их применение может быть ограничено из-за плохой сохранности ДНК в экскрементах и высокой стоимости и сложности лабораторных работ. Тем не менее лишь генетические методы могут быть использованы при анализе родственных отношений внутри отдельно взятых группировок кошачьих (Рожнов и др., 2009), а также при проведении криминалистических исследований, связанных с идентификацией животных (Coomber et al., 2007).
Дальневосточный леопард характеризуется самым низким генетическим разнообразием среди всех подвидов леопарда. Оно сравнимо с таковым флоридской пумы (Puma concolor coryi) и азиатского льва (Panthera leo pérsica), для которых отмечено снижение жизнеспособности в результате инбридинга (Driscoll et al., 2002; Uphyrkina et al., 2002). Предполагается, что популяции дальневосточного леопарда могли потерять генетическую изменчивость за короткий период в результате дрейфа генов (Uphyrkina, O'Brien, 2003). Это может стать причиной вымирания подвида в недалеком будущем даже при условии надлежащей охраны и сохранения подходящих местообитаний. Поэтому оценка генетического разнообразия и выявление его временной динамики имеет огромное практическое и теоретическое значение для сохранения малочисленных изолированных группировок дальневосточного леопарда.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нами проведен молекулярно-генетический анализ ДНК, выделенной из экскрементов, шерсти, крови и мышц дальневосточных леопардов. Фрагменты экскрементов (32 образца) размером около 1 см3 и шерсть (один образец) собирали в пробирки объемом 10 мл с 96%-ным этиловым
Таблица 1. Характеристика собранных образцов дальневосточного леопарда, использованных для генетического анализа
Индивидуальное обозначение животного Пол Тип Дата сбора
s38 f Экскремент 02.09.2010 г.
7a m » 17.02.2010 г.
8a m » 02.09.2010 г.
9a m » 28.03.2010 г.
27s f » 15.02.2010 г.
7a m » 22.02.2011 г.
s7 f » 17.02.2011 г.
s24 m » 18.02.2011 г.
s20 f » 09.02.2011 г.
s20 f » 09.02.2011 г.
s38 f » 08.02.2011 г.
s20 f » 14.02.2011 г.
s24 m » 12.02.2011 г.
s24 m » 17.02.2011 г.
7a m » 20.02.2011 г.
s18 f » 14.02.2011 г.
s44 m » 18.02.2011 г.
7a m » 13.02.2011 г.
s20 f » 09.02.2011 г.
7a m » 03.02.2011 г.
s24 m » 12.02.2011 г.
s44 m » 08.02.2011 г.
1b m Кровь 13.08.2011 г.
2b m » 14.08.2011 г.
3b m » 09.09.2011 г.
4b f » 09.08.2011 г.
5b f » 23.08.2011 г.
s38 f » 10.10.2011 г.
v1* f Мышцы 15.02.2009 г.
v2* f » 15.02.2009 г.
3b m Экскремент 05.01.2012 г.
3k m » 22.12.2011 г.
35a f » 28.12.2011 г.
38a f » 31.12.2011 г.
40a m » 08.01.2012 г.
44a m » 09.01.2012 г.
31 m » 17.02.2012 г.
211 m Шерсть 21.01.2012 г.
s20 f Экскремент 28.12.2011 г.
21 m » 17.02.2012 г.
44a m » 16.01.2012 г.
Примечание. т — самец, f — самка. *Ткани от погибшей самки и ее эмбриона.
Таблица 2. Генетическое разнообразие проанализированных локусов
Локус N HO He PIC
Fca 8 4 0.36 0.32 0.30
Fca 26 5 0.71 0.65 0.59
Fca211 2 0.40 0.47 0.36
Fca 43 3 0.48 0.48 0.38
Fca 105 2 0.14 0.21 0.18
Fca 224 2 0.63 0.44 0.34
Fca 90 2 0.52 0.46 0.35
Fca 229 3 0.52 0.60 0.50
Fca 247 2 0.06 0.25 0.21
Fca 97 2 0.22 0.26 0.23
Fca 96 3 0.40 0.57 0.47
Fca 441 4 0.30 0.70 0.63
Среднее 2.83 (1.03) 0.39 (0.03) 0.45 (0.05) 0.38
Примечание. N — число аллелей, HO — ожидаемая гете-розиготность, HE — наблюдаемая гетерозиготность, PIC — степень информативности полиморфизма.
спиртом в 2010—2012 гг. в Юго-Западном Приморье. Основной материал собран в бассейнах рек Ананьевка и Нежинка на площади около 85 км2. Пробы крови от шести отловленных в 2011 г. леопардов консервировали в пробирках с K3EDTA. Пробы мышц от погибшей самки и ее эмбриона консервировали в 96%-ном этиловом спирте. Места и даты сбора проб представлены в табл. 1 и на рисунке.
Для выделения ДНК из экскрементов использовали наборы QIAamp stool mini kit (Qiagen, США) и InviMagStoolDNAKF96 kit (Invitek, Германия) с роботизированной станцией KingFisher Flex (KingFisher, Германия), для выделения ДНК из крови и мышц — набор Diatom DNA Prep 100 (Изоген, Россия).
Для анализа ядерной ДНК использовали 12 микросателлитных локусов с праймерами (в скобках — флуоресцентная краска) fca8 (fam), fca26 (r6g), fca211 (tamra), fca43 (fam), fca105 (rox), fca224 (r6g), fca90 (fam), fca229 (rox), fca 247 (tamra), fca97 (fam), fca96 (fam), fca 441 (tamra) (Menot-ti-Raymond et al., 1999; Рожнов и др., 2011), а для определения пола — праймеры Zn (fam) (Bhaga-vatula, Singh, 2006). С целью уменьшения вероятности ошибки при индивидуальной идентификации полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили 4 раза, после чего определяли консенсусный генотип, встречающийся как минимум 3 раза для гомозиготы и 2 раза для гетерозиготы. Вероятность ошибки (PIDsib) при совпадении генотипов
рассчитывали исходя из частот аллелей определенных локусов для всей проанализированной выборки с помощью программы GeneCap (Wilberg, Dreher, 2004). Значения ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, соответствие закону Харди—Вайнберга, сцепление локусов и наличие нулевых аллелей проверяли в программах Arlequin 3.5 (Excoffier, Lischer, 2010) и Cervus 3.0 (Kali-nowski et al., 2007). Для конвертации данных использовали программу Ms tool (Park, 2001). Длины микросателлит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.