РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 6, с. 658-666
АДАПТИВНЫЙ ^^^^^^^^^^^^^^ ОТВЕТ
УДК [577.2+576]:539.1.04
ИНДИВИДУАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ В ПРОЯВЛЕНИИ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ. ПОДХОДЫ К ЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЮ
© 2007 г. И. И. Пелевина1*, А. А. Алещенко2, М. М. Антощина3, Н. И. Рябченко3,
Л. П. Семенова2, А. М. Серебряный2
1 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, 2 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва,
3 Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
В работе проанализированы результаты собственных экспериментальных исследований и данные литературы о механизмах формирования адаптивного ответа (АО), о его вариабельности, факторах, на него влияющих. На лимфоцитах крови человека при помощи микроядерного теста с цито-кинетическим блоком цитохалазином и метафазного анализа хроматидных аберраций хромосом были изучены изменения состава клеточной популяции, пролиферативный индекс, проявление АО или феномена повышенной чувствительности после облучения в малой адаптирующей (5 сГр) и высокой разрешающей (1.0 Гр) дозах в фазах 01 и 02 (24 и 48 ч после стимуляции ФГА) соответственно. Фиксацию клеток проводили через 50 ч (через 2 ч после добавления демеколцина) и 72 ч (через 48 ч после добавления цитохалазина В). Критериями оценки служили изменение состава клеточной популяции, частота клеток с микроядрами в двуядерных клетках (на 1000 всех двуядерных клеток), частота клеток с аберрациями хромосом (на 100 метафаз). Было показано, что изменение состава популяции, проявление АО и его механизмы зависят от индивидуальных особенностей каждого человека. Оценки (наличия-отсутствия АО) по показателям частоты клеток с микроядрами и клеток с аберрациями хроматидного типа не совпадают (совпадение отмечается в трех случаях из 15). Предполагается, что в 02 фазе цикла после облучения в разрешающей дозе при микроядерном тесте и метафазном анализе аберраций хромосом регистрируются разные клетки (через 24 ч и 2 ч после остановки митозов, соответственно). Изменение состава клеточной популяции может, вероятно, влиять на окончательную оценку АО, но не является его механизмом. Главный механизм формирования АО - это защита от повреждений разными путями. Формирование АО зависит от многих факторов и индивидуальных особенностей, выявляется при использовании определенных критериев оценки, с учетом определенной генетической конституции. Это позволяет ставить вопрос об универсальности АО.
Лимфоциты, облучение, адаптивный ответ, микроядра, хромосомные аберрации.
В течение последних 20 лет, со времени открытия адаптивного ответа (АО) клеток млекопитающих на воздействие ионизирующей радиации, впервые продемонстрированного на лимфоцитах человека [1], интерес к этому феномену только возрастает. До сих пор нет полной ясности о его механизмах, факторах его определяющих, степени индивидуальной вариабельности у разных организмов. Можно сказать, что это индуцибель-ный процесс, возникающий после воздействия ге-нотоксических агентов в малых дозах, который приводит к защитному эффекту от последующего воздействия в высокой (разрешающей) дозе
* Адресат для корреспонденции: 119334 Москва, ул. Косыгина, 4, Институт химической физики РАН; тел.: (495) 93974-47; e-mail: pele@chph.ras.ru.
того же или другого агента. Адаптивные реакции были обнаружены на клетках млекопитающих и растений, при использовании разных по природе мутагенов (химических алкилирующих соединений, радиации, активных форм кислорода и др.) и разных критериев оценки наблюдаемого эффекта, главным образом хромосомных и хроматидных аберраций, микроядер (МЯ), мутаций.
На лимфоцитах крови человека феномен АО был проанализирован в целом ряде исследований [2-7]. Триггером адаптивного процесса является воздействие фактора в низких дозах (для радиации - 2-5 сГр). АО выявляется через определенное время (не менее, чем 4 ч после адаптирующего воздействия), частота проявления и степень его выраженности зависят от стадии клеточного
цикла [8-10]. Для возникновения АО необходим синтез ряда белков и полиАДФ-рибозы [11, 12]. По некоторым данным АО, оцениваемый по частоте аберраций хромосом, обнаруживается при воздействии радиации во всех фазах клеточного цикла и может объясняться снижением количества двунитевых разрывов ДНК, вызываемых облучением в разрешающей дозе [13]. Существенно, что при индукции АО экспрессируются совсем другие гены (несмотря на воздействие фактора в адаптирующей дозе), чем в случае его отсутствия [14]. Предполагается, что гены, ассоциированные с адаптивным ответом, - это гены репарации ДНК, стрессовой реакции, контроля клеточного цикла и, возможно, причастные к механизму формирования АО.
В настоящей работе феномен АО проанализирован с точки зрения универсальности его проявления при использовании разных показателей -микроядер и аберраций хроматидного типа. Изучены влияния изменения пролиферативной активности клеточной популяции, участия клеток разных типов (с микроядрами и без) на проявление АО, а также наличия индивидуальных различий исследуемых организмов как возможной причины различий проявления и выраженности АО.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Донорами крови служили здоровые люди обоего пола в возрасте 20-35 лет.
Для определения АО использовали два широко применяемых метода - микроядерный тест, основанный на цитокинетическом блоке с цитоха-лазином В, стимулированных к пролиферации лимфоцитов, и метафазный анализ хромосом, которые подробно описаны в работах [6, 10, 15-18]. Для стимуляции к делению культивированных лимфоцитов крови прибавляли фитогеммаглю-тинин (ФГА), через 24 ч клетки облучали в фазе Gj-цикла на источнике ГУТ-60Со при мощности дозы 75 сГр/мин вначале в адаптирующей дозе 0.05 Гр, а затем еще через 24 ч - в разрешающей дозе 1.0 Гр. Параллельно часть проб либо вообще не облучали, либо в соответствующие моменты времени облучали только в дозе 0.05 Гр, либо только в дозе 1.0 Гр. При использовании микроядерного теста через 48 ч после начала стимуляции клеток в культуральную среду вводили ингибитор цитокинеза цитохалазин В до концентрации 6 мкг/мл и продолжали культивирование клеток еще 24 ч (до 72 ч). Затем клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0.125 моль/л KCl, фиксировали в смеси метанол-ледяная уксусная кислота (3:1) и наносили на предметные стекла. Высохшие мазки окрашивали азур-эози-ном. В каждом варианте опытов каждый препарат анализировали два независимых счетчика.
АО определяли по доле двуядерных клеток с микроядрами среди не менее 1000 всех просчитанных двуядерных клеток. Достоверность различий в частотах появления лимфоцитов с микроядрами после облучения однократно в дозе 1.0 Гр или в двух дозах (5 сГр + 1.0 Гр) оценивали с помощью критерия х2.
Дополнительно для каждого индивидуума в препаратах исследовали состав ядросодержащих -подсчитывали число одно (ОЯ)-, дву (ДЯ)- и многоядерных (МнЯ) клеток с микроядрами и без них, а также клетки в стадии митоза (на 1000 клеток).
Пролиферативный индекс ПИ рассчитывали как сумму ОЯ + (2 х ДЯ) + (3 х МнЯ), деленную на число просчитанных клеток согласно работе [17].
В процедуре метафазного анализа аберраций хромосом использовали стандартную методику культивирования лимфоцитов периферической крови [19]. При той же схеме облучения, что и при использовании МЯ теста через 48 ч после стимуляции лимфоцитов к пролиферации к культуре крови прибавляли демеколцин для накопления клеток в метафазе; клетки фиксировали через 2 ч (т.е. 50 ч после начала стимуляции). Поскольку облучение в высокой дозе проводили в фазе С2-цикла, все обнаруженные аберрации были хроматидного типа (одиночные фрагменты, обмены, изолокусные разрывы).
Достоверность наличия АО оценивали с помощью критерия х2 и /-критерия Стьюдента [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В первой серии экспериментов были изучены различия в культурах лимфоцитов 10 здоровых доноров, при облучении в дозах 1.0 Гр и 0.05 Гр по клеточному составу и пролиферативному индексу (ПИ) (табл. 1).
Оказалось, что по результатам изучения ПИ обследованных индивидуумов можно отнести к одному из 3 типов: с высоким ПИ стимулированных к делению лимфоцитов - 2.06-2.0 (4 человека), с ПИ - от 1.97 до 1.49 (5 человек) и с низким ПИ - 1.12 у одного индивидуума.
Полностью результаты изучения выраженности ПИ в необлученной популяции лимфоцитов представлены в табл. 1, из которой видно, что индивидуальные колебания в содержании разных типов клеток велики.
Анализ результатов показывает, что популяция лимфоцитов, изначально синхронная (находящаяся в фазе G0), после стимуляции ФГА продвигается по клеточному циклу не синхронно. В ней имеются субпопуляции клеток медленно продвигающихся по циклу (одноядерные клетки), а также те, которые быстро приходят к митозу, - двуядер-ные клетки, (при задержке цитокинеза цитохала-
Таблица 1. Состав клеточной популяции лимфоцитов крови человека и его изменение после облучения
о
ч А И И А С И О Н
Н А
»
Б И
О
а О
ч И
^
ч А
И И
О
ш
К О
а О
ч И
Я
г
6
(О
о о о
Донор № 1 Донор № 2 Донор № 3 Донор № 4 Донор № 5
Состав лимфоцитов Доза, Гр Доза, Гр Доза, Гр Доза, Гр Доза, Гр
0 1.0 0.05 + 1.0 0 1 0.05 + 1.0 0 1 0.05 + 1.0 0 1 0.05 + 1.0 0 1.0 0.05 + 1.0
ОЯ 84 381 528 257 311 328 178 172 508 453 568 470 251 353 420
ДЯ 459 533 354 566 555 470 479 479 219 513 351 444 596 479 460
МнЯ 383 5 3 141 62 83 245 171 58 2 8 2 115 68 25
МЯ в ОЯ 2 0 3 0 3 2 0 1 32 1 6 1 0 1 0
МЯ в ДЯ 7 51 96 4 29 70 12 95 76 6 44 52 6 58 55
МЯ в МнЯ 22 4 3 9 9 25 50 66 50 0 0 4 13 19 20
Всего клеток с МЯ 31 55 102 13 41 97 62 161 158 7 58 57 19 78 75
Митозов 43 26 13 23 31 22 36 51 57 25 23 27 19 22 20
ПИ 2.6 1.6 1.4 1.99 1.76 1.84 2.3 2.09 1.56 1.5 1.39 1.49 1.97 1.78 1.45
Донор № 6 Донор № 7 Донор № 8 Донор № 9 Донор № 10
Состав лимфоцитов Доза, Гр Доза, Гр Доза, Гр Доза, Гр Доза, Гр
0 1.0 0.05 + 1.0 0 1.0 0.05 + 1.0 0 1.0 0.05 + 1.0 0 1.0 0.05 + 1.0 0 1.0 0.05 + 1.0
ОЯ 850 758 767 417 473
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.