и быстро понижающееся в послеполетный период [15, 16]. Все описанные цитогенетические нарушения характерны для воздействия радиации, но, безусловно, нельзя исключить, что причиной могли быть и другие факторы, перечисленные выше.
Однако в цитируемых работах оценивалась лишь принципиальная возможность возникновения генотоксических эффектов путем сравнения средних показателей по всей исследуемой группе с контролем. Анализа вариабельности показателей, различий в чувствительности отдельных лиц не проводилось.
Следует учитывать, что космонавты и пилоты являются здоровыми, физически активными людьми, относительно молодыми, подвергающимися тщательным медицинским обследованиям до и после полетов. Разработана система медицинского отбора космонавтов, определяющая целесообразность повторных космических полетов, оптимальных интервалов между ними, включающая и наземные экспериментальные исследования, показывающие необходимость определенного периода адаптации [17]. Но и среди отобранных физически здоровых людей могут оказаться индивидуумы с повышенной чувствительностью к воздействию радиации, с пониженной способностью адаптации к условиям, создающимся на высоте.
Учитывая все сказанное, представляется важным изучение влияния условий полета по показателям, способным оказывать влияние на здоровье космонавтов, пилотов, членов экипажа, проводящих длительное время на высоте. Предполагается, что молекулярно-биологические и цитогенетические нарушения в лимфоцитах крови являются одними из немногих ранних и чувствительных биомаркеров, которые могут дать информацию о том риске, которому подвергается человек [18]. Изучение подобных биомаркеров у пилотов и космонавтов приобретает особое значение, так как может служить ранним показателем нарушения организменного гомеостаза.
Обнаруженные явления необходимо учитывать еще и потому, что в настоящее время можно считать доказанным, что радиация в малых дозах (~0.2 Гр) может вызывать целый ряд эффектов на всех уровнях биологической организации - экспрессию специфических генов [19], повреждения генетического аппарата [20, 21], нестабильность генома [22-25], адаптивный ответ и повышение радиочувствительности [26]. На уровне организма повышается риск возникновения злокачественных опухолей, ряда неопухолевых заболеваний [27, 28].
Целью настоящей работы являлось изучение индивидуальных молекулярно-биологических и цитогенетических изменений в лимфоцитах крови у пилотов и космонавтов после полета, чув-
ствительности их к условиям полета, к дополнительной радиационной нагрузке (путем облучения лимфоцитов вне организма в дозе 1 Гр); способности к адаптивному ответу, выраженность которой является важным показателем потенциала резистентности клеток и организмов к экстремальным условиям.
Дело в том, что способность к адаптации (адаптивный ответ, АО) - общая индуцибельная реакция клеток и организмов на воздействие химических и физических агентов в малых дозах, выражающаяся в повышении резистентности к последующему воздействию тех же или других агентов в высоких дозах. Было обнаружено, что у некоторых индивидуумов после облучения в малых дозах отмечается не повышение резистентности, а повышение чувствительности, что может свидетельствовать о нарушениях в системе гомеостаза организма [29].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Всего было обследовано 15 пилотов, 6 космонавтов, 16 контрольных доноров (мужчин в возрасте до 50 лет). Объектом исследования служили лимфоциты периферической крови.
Анализ поврежденности ДНК и клеточной радиочувствительности
Выделение лимфоцитов из гепаринизирован-ной крови проводили путем центрифугирования в градиенте плотности "Histopaque" ("Sigma") в соответствии с прилагаемой инструкцией. После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензи-ровали в боратном буфере (0.14 моль/л NaCl, 10 ммоль/л №2ЕДТА, 45 ммоль/л Н3ВО3, 14 ммоль/л Na2B4O7, рН 8.3) до конечной концентрации 1-2 х 106 клеток/мл. Ранее было показано, что боратный буфер ингибирует репарацию ДНК [30].
Поврежденность ДНК лимфоцитов определяли методом ДНК-комет - электрофореза единичных клеток в нейтральных условиях в собственной модификации. Уровень разрывов ДНК, определяемых этим методом, оценивается по увеличению количества ДНК, мигрировавшей из ядерной области, и расстояния ее миграции при электрофорезе иммобилизованных в агарозу единичных клеток.
20 мкл суспензии лимфоцитов смешивали со 100 мкл 0.5%-ного раствора легкоплавкой агаро-зы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере с рН 7.4 при температуре 37°С и наносили на предметные стекла, предварительно покрытые 1%-ным слоем нормоплавкой агарозы, которые накрывали покровными стеклами и выдерживали 5 мин при 4°С на предварительно охлажденной металлической пластине. После солидификации агарозы
покровные стекла удаляли и полученные слайды помещали в охлажденный (4°С) боратный буфер.
Облучение проводили на у-установке 60Co "Луч" ("Изотоп", Россия) в дозе 1 Гр при мощности дозы 0.35 сГр/мин. Контрольные препараты выдерживали в течение срока, равного времени облучения в боратном буфере.
Через 1-2 мин после окончания облучения слайды переносили в холодный (4°C) лизирую-щий буфер (2.5 моль/л NaCl, 100 моль/л Na2E^TA, 20 моль/л трис-HCl с pH 10.0, 1% тритон X-100 и 10% диметилсульфоксид (ДМСО) в течение 2 ч. После лизиса клеток слайды переносили в холодный (4°C) трис-боратный буфер TBE с рН 8.2 ("Sigma") и выдерживали 20 мин. Электрофорез проводили в TBE-буфере при напряжении 1.5 В/см при температуре 4°С в течение 20 мин. После электрофореза слайды слегка подсушивали и фиксировали в 96%-ном этаноле в течение 10 мин.
Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый ("Sigma") (2 мкг/мл в фосфатно-соле-вом буфере с рН 7.4). Окраску приводили в течение 10 мин в полной темноте. Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью микроскопа "МИКМЕД-2 вар. 11" ("ЛОМО", Россия) и видеосистемы на основе цифровой камеры "Nikon Coolpix 4500". Фильтр возбуждения "ФС1-5" (400-440 нм), запирающий фильтр 515 (515 нм). Использование запирающего фильтра 515 позволяет фиксировать преимущественно "зеленую" флуоресценцию, характерную для комплексов акридиновый оранжевый-двунитевая ДНК. Для анализа ДНК-комет использовали программу "CometScore" ("TriTek Corp". http: //tritekcorp.com). Оценивали величину "момента хвоста" Оливе (МХО) (произведение расстояния от центра ядра до центра плотности хвоста кометы на % ДНК в хвосте).
Статистическую обработку результатов ко-мет-теста проводили следующим образом. У каждого обследуемого после электрофореза измеряли МХО 75 комет и по результатам обычным образом рассчитывали среднюю величину МХО, ее стандартное отклонение и стандартную ошибку. Эти результаты характеризовали конкретного индивидуума. Затем создавали обобщенный контрольный массив на основании всех данных электрофореза для контрольных доноров и, соответственно, массивы данных по группам пилотов и космонавтов и рассчитывали параметры этих массивов.
Метафазный анализ аберраций хромосом
В опытах по определению частоты аберраций хромосом лимфоциты периферической крови культивировали в среде RPMI 1б40 с добавлением глютамина (2 ммоль/л), пенициллина (100 ед/мл),
20% эмбриональной телячьей сыворотки. После введения 10 мкг на пробу фитогемагглютинина (ФГА) (все реактивы фирмы "ПАНЭКО", Москва) клетки инкубировали в течение 51 ч в термостате при 37°С. Для накопления метафазных пластинок в культуральную среду за 2 ч до фиксации вводили колхицин в концентрации 0.5 мкг/мл. Для получения цитологических препаратов клетки гипо-тонизировали 0.075 моль/л KCl в течение 15 мин при 37°С, затем фиксировали смесью ледяной уксусной кислоты и метилового спирта в соотношении 1 : 3. Препараты готовили, раскапывая взвесь клеток на влажные охлажденные стекла, высушивали и окрашивали 0.1%-ным раствором азур-эозина по Гимза.
Для изучения адаптивного ответа цельную кровь (стадия G0) подвергали воздействию у-излу-чения 60Со в адаптирующей дозе 0.05 Гр (мощность дозы 0.18 Гр/мин). Через 48 ч культивирования лимфоцитов с ФГА клетки облучали на стадии G2 в повреждающей дозе 0.5 Гр и фиксировали через 3 ч. Подсчитывали частоту метафаз с аберрациями хромосом, общее число аберраций хромосом на 100 клеток. Определяли их исходный уровень, а также частоту аберрантных клеток и число аберраций хромосом после облучения в дозах 0.05 Гр, 0.5 Гр и вначале в дозе 0.05 Гр, а через 48 ч в дозе 0.5 Гр. Достоверность различий в частотах появления лимфоцитов с аберрациями хромосом в разных вариантах опытов оценивали с помощью критериев Стьюдента и %2. Различия признавались значимыми при p < 0.05. Тип адаптивного ответа определяли, сравнивая результаты опытов после облучения в дозе 0.5 Гр и совместно 0.05 + 0.5 Гр (по критерию %2).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В группу летчиков вошли пилоты гражданской авиации, летавшие на разной высоте (600017000 м), различное количество часов (от 56 до 3500 ч) и получившие облучение в дозах от 0.019 до 1.4 сГр (расчетные цифры) [31]. Характеристика условий полета для каждого индивидуума приведена в табл. 1.
Космонавты подвергались исследованиям спустя 10-20 лет после завершения полетов с длительностью пребывания в космосе от 10 до 679 сут (суммарно за несколько полетов). Дозы облучения, рассчитанные по показаниям индивидуальных дозиметров, составляли от 0.14 до 13.29 сГр (табл. 1).
Определение степени поврежденности ДНК и клеточной радиочувствительности методом ДНК-комет
Из рис. 1 видно, что в контрольной когорте исходно отмечаются незначительные индивидуаль-
Таблица 1. Характеристика условий полетов летчиков и космонавтов
Обследованная группа
Летчики
Космонавты
омер Условия полетов Доза облучения, сГр
высота, м налет, ч
1 8000 2500 0.40
2 8000 2500 0.40
3 17000 2000 1.0
4 8000 60 0.025
5 7000 75 0.03
6 7000 2500 0.35
7 17000 2340 1.4
8 5000 3500 1.2
9 6000 730 0.25
10 6000 2500 0.40
11 6000 780 0.25
12 6000 56 0.019
13 6000 2350 0.40
14 7000 60 0.025
15 8000 75 0.03
Время в космосе, сут
1 186 9.60
2 11 0.14
3 382 12.80
4 327 9.85
5 679 13.29
6 10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.