ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 1, с. 60-69
=ЗООЛОГИЯ =
УДК 575.852113:599.742.4
ИНДИЙСКИЙ СОЛОНГОЙ Mustela kathiah (Carnivora: Mustelidae) -МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КАРИОЛОГИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
© 2013 г. А. В. Абрамов*, ***, И. Г. Мещерский**, В. М. Анискин**, В. В. Рожнов**, ***
*Зоологический институт РАН, 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 1 **Институт проблем эволюции и экологии им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 ***Совместный Российско-Вьетнамский Тропический научно-исследовательский и технологический центр, Ханой, Кау Гиай, Нгиа До, Нгуен Ван Хиен E-mail: rozhnov.v@gmail.com Поступила в редакцию 14.02.2012 г.
Впервые описан кариотип Mustela kathiah. По своей структуре он наиболее близок к кариотипу M. altaica, отличаясь в морфологических особенностях пяти пар крупных хромосом. Сравнительный анализ митохондриальных генов у видов Mustela позволил уточнить представления о положении M. kathiah в системе рода. Предполагавшаяся ранее близость вида к группе мелких ласок (altaica, nivalis) или к группе южноазиатских видов (strigidorsa, nudipes) не нашла подтверждения. Обнаружен высокий уровень отличий M. kathiah из Вьетнама от экземпляров из южного Китая по нуклеотидной последовательности генов цитохрома b (7.7%) и ND2 (6—6.2%). Возможно, эти отличия, проявляющиеся в популяциях M. kathiah из разных регионов, имеют адаптивный характер.
DOI: 10.7868/S0002332913010025
Род Mustela Linnaeus, 1758 — самый многочисленный по числу видов в семействе Mustelidae (Carnivora). В этот род включают 17 видов: M. africana, M. altaica, M. erminea, M. eversmanii, M. fe-lipei, M. frenata, M. itatsi, M. kathiah, M. lutreola, M. lutreolina, M. nigripes, M. nivalis, M. nudipes, M. putorius, M. sibirica, M. strigidorsa, M. subpalmata (Abramov, 2000; Wozencraft, 2005). Виды рода Mus-tela широко распространены в Европе, Азии, Северной Африке, Северной и Южной Америке. Многие палеарктические и североамериканские виды этого рода достаточно хорошо изучены, однако некоторые виды из Южной Азии и Южной Америки до сих пор почти не исследованы.
Индийский солонгой M. kathiah Hodgson, 1835 — один из самых малоизученных видов рода Mustela. Этот хищник распространен в северной Индии, Непале, Бутане, Южном и Юго-Восточном Китае, Мьянме, северном Таиланде, Лаосе и Вьетнаме. Индийский солонгой представлен в мировых научных коллекциях лишь единичными экземплярами, и вследствие этого плохо изучен морфологически и генетически. Таксономическое положение вида и его филогенетические отношения с другими представителями Mustela не исследованы. Ранее индийского солонгоя вместе с другими южноазиатскими видами Mustela (M. strigidorsa, M. nudipes) рассматривали в составе
самостоятельного рода Gymnopus (Gray, 1865). Другие исследователи сближали индийского солонгоя с горностаем M. erminea и длиннохвостой лаской M. frenata (Pocock, 1921) или объединяли всех мелких Mustela (M. kathiah, M. erminea, M. nivalis и M. altaica) в один номинативный подрод (Ellerman, Morrison-Scott, 1951; Youngman, 1982; Павлинов и др., 1995). На основании морфологических данных M. kathiah рассматривается в составе отдельного подрода Gale, включающего также ласок M. nivalis и M. subpalmata и солонгоя M. altaica (Abramov, 2000).
Изучены кариотипы всех палеарктических видов рода Mustela (Орлов, Булатова, 1983). Значительно хуже обстоит дело с южными представителями Mustela — для некоторых из них отсутствуют даже сведения о диплоидных наборах хромосом. Молекулярно-генетические исследования последних лет позволили прояснить филогенетические связи палеарктических видов Mustela (Kuro-se et al., 2000, 2008; Sato et al., 2003, 2009a; Hosoda et al., 2011), но положение южноазиатских видов, в том числе M. kathiah, все еще остается неясным.
В статье впервые приведены данные о хромосомном наборе индийского солонгоя и предпринята попытка сравнительного анализа кариотипа M. kathiah с таковыми ранее изученных видов. Проведенный анализ митохондриальных генов
позволил уточнить представления о филогенетических связях внутри Mustela и положении индийского солонгоя в системе рода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проведен анализ образцов (кратковременная культура клеток костного мозга, мышечная ткань) индийского солонгоя M. kathiah из южного Вьетнама (провинция Ламдонг, Далатское плато). Экземпляр хранится в коллекции ИПЭЭ РАН.
Хромосомные препараты получены из кратковременной культуры клеток костного мозга с применением модифицированной колхициновой методики (Ford, Hamerton, 1956). Извлеченные клетки инкубировали в 5 мл 0.075 M раствора KCl при температуре 37°С, затем фиксировали в смеси метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3 : 1) в течение 40 мин. Фиксатор меняли дважды с промежуточным ресуспензированием и центрифугированием. Полученные препараты окрашивали 4%-ным красителем Гимза.
Выделение ДНК из образца мышечной ткани, фиксированной в 96%-ном этаноле, проводили с использованием набора реагентов Diatom™ DNA Prep (OOO "Лаборатория Изоген", Россия), амплификацию выбранных участков — набора Master Mix 2025 (ПКЗАО Диалат Лтд, Россия), постановку сиквенсовой реакции — набора BigDye Terminator v.3.1. (Applied Biosystems, США).
В ходе работы были исследованы участки, ам-плифицированные с использованием указанных ниже праймеров:
ген цитохрома b: CVS-f1: TTCCTACATG-GAATTTAACCATGA, CVS-f2: ATATTCCCA-GAAACATGAAACATC, CVS-r1: TCTCCATTT-TTGGTTTACAAGAC, CVS-r2: CGGGTT-TAATATGGGGTGGT (Рожнов и др., 2006, 2008); в парах CVS-f1/CVS-r1, CVS-f1/CVS-r2, CVS-f2/CVS—r1 при температуре отжига 54°С, а также kathiah—cb2F: AGTGACATGAAAAATCACTGT-TG, kathiah—cb2R: TTGGTTTACAAGACCAAAG-TAATTG, в паре друг с другом и в парах kathiah— cb2F/CVS—r1 и CVS-f1/ kathiah-cb2R при температуре отжига 54°С;
контрольный регион митохондриальной ДНК: DVS-f1: CCTCCCTAAGACTCAAGGAAGAA, DVS-Í2: AATCAGCCCATGATCACACA, DVS—r1: GGCTAGGACCAAACCTTTATG, DVS—r2:
TGTCCTGTGACCATTGACTGA (Рожнов и др., 2008), в парах DVS-f1/DVS-r1, DVS-f1/DVS-r2, DVS-f2/DVS-r1 при температуре отжига 54°С;
ген второй единицы НАДФ-дегидрогеназы (ND2): cet-nd2F: CATACCCCGAAAATGTTGGT, cet-nd2R: TAGGGCTTTGAAGGCTCTTG при температуре отжига 54°С, а также ND2-FelF и ND2-melExtR (Yu, Zhang, 2006; Sato et al, 2009b) в указанных парах;
ген 12S РНК: праймеры 12S-L5 и 12S-H3 (Ledje, Arnason, 1996), температура отжига 55°С;
экзон 1 гена IRBP: пары праймеров IF217/IR1531; IF217/IR954; IF835/IR1531 (Sato etal., 2003; Yu et al., 2004), температура отжига 55°С.
Сиквенсовая реакция для каждого вида продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР) ставилась дважды — с прямым и обратным для данного ампликона праймером, с последующим определением нуклеотидных последовательностей на автоматическом анализаторе AB 3130 (Applied Biosystems). Полученные фрагменты каждого участка совмещали, а в дальнейшем выравнивали с известными последовательностями с использованием программы BioEdit v.7.0.1 (Hall, 1999). Для сравнения были использованы представленные в базе GenBank данные для всех изученных в настоящее время видов рода Mustela. Математическую обработку (построение фило-грамм, подбор оптимальной для анализа модели и оценку генетических дистанций) проводили с использованием программы MEGA5 (Tamura et al., 2011).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Кариологические данные. У изученного самца M. kathiah диплоидное число (2n) равно 44, число плеч хромосом NFa = 74. Кариотип включает 9 пар мета- и субметацентриков (1—9-я пары) и 12 пар субтело- и акроцентрических аутосом. X-хромосома представлена субметацентриком средних размеров, Y-хромосома — наименьший элемент набора (рис. 1).
Цитогенетические исследования палеарктиче-ских видов рода Mustela показали, что число хромосом в этой группе изменяется от 38 до 44, а число плеч аутосом варьирует от 60 до 74 (Графодат-ский и др., 1976, 1977; Pathak, Wurster-Hill, 1977; Mandahl, Fredga, 1980). Применение методов дифференциальной окраски позволило установить, что изменения по числу хромосом обусловлены Робертсоновскими перестройками, а вариации числа плеч аутосом и их морфологии связаны с изменением количества С-положительного ге-терохроматина.
Только два из ранее изученных видов Mustela (солонгой M. altaica и горностай M. erminea) характеризуются диплоидным числом, равным 44, число плеч аутосом равно 74 и 60 соответственно (Орлов, Булатова, 1983). Анализ показал, что кариотип M. kathiah по своей структуре наиболее близок к хромосомному набору M. altaica. Несмотря на полную тождественность по диплоидному числу и числу плеч аутосом, отмечены морфологические особенности пяти пар крупных хромосом, которые проявляются в различном положении центромерных районов. Учитывая дан-
II 1 II 2 II 3 It 4 99 5
es 6 8« 7 шт 8 as 9
al 10 АД 15 •в 11 АД 16 Al 12 «А 17 АА 13 А* 18 ДА 14 19
mm 20 *« 21 А* X Y
Рис. 1. Кариотип Mustela kathiah из южного Вьетнама. 1—21 — аутосомы, X, Y — половые хромосомы.
ные ранее проведенных исследовании, в которых выявлена высокая степень консерватизма эухро-матической части генома у видов рода Mustela, можно допустить, что эти различия обусловлены изменением количества гетерохроматина. Отсутствие данных по дифференциальной окраске хромосом оставляет открытым вопрос о степени близости кариотипов M. kathiah и M. altaica.
Данные молекулярно-генетического анализа. В ходе анализа получены последовательности генов: цитохром b (1140 пар нуклеотидов (пн), полная последовательность), 12S (955 пн, полная последовательность), ND2 (1029 пн, частичная последовательность за отсутствием двух триплетов в начале и двух в конце гена), экзона 1 гена IRBP (1275 пн, частичная последовательность), а также полная последовательность контрольного региона митохондриальной ДНК (1081 пн). Полученные последовательности представлены в базе данных GenBank под номерами JQ965760— JQ965764. В наибольшей степени генетическое разнообразие представителей рода Mustela изучено на основании последовательностей гена цито-хрома b. Для сравнительного анализа были использованы представленные в GenBank последовательности гена цитохрома b. Среди записе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.