= НЕИОНИЗИРУЮЩИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ
УДК 614.875:599.325.1:591.111.1
ИНДУКЦИЯ АГРЕГАЦИИ НАТИВНЫХ ТРОМБОЦИТОВ СРЕДОЙ ИНКУБАЦИИ ОБЛУЧЕННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОЛИКА: ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ АДФ © 2014 г. А. К. Аносов*, М. М. Горбач
Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва
Установлено, что в среде инкубации изолированных лейкоцитов крови кролика, подвергнутых воздействию УФ-излучения, накапливаются соединения, индуцирующие агрегацию нативных тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазмы. Нагревание среды инкубации фотомодифи-цированных лейкоцитов до 100°С не вызывает разрушения этих соединений. В спектре поглощения среды инкубации фотомодифицированных лейкоцитов выявляется максимум, характерный для АДФ. Обработка обогащенной тромбоцитами плазмы средой инкубации лейкоцитов в условиях, исключающих агрегацию, вызывает у тромбоцитов развитие рефрактерности к АДФ. Обработка же тромбоцитарных клеток АДФ в аналогичных условиях вызывает появление рефрактерности к среде инкубации фотомодифицированных лейкоцитов. Можно полагать, что УФ-излучение вызывает высвобождение АДФ из облученных лейкоцитов в ходе их инкубации после облучения, который, накапливаясь в среде инкубации, и является причиной появления у этой среды проагрегационной активности в отношении нативных тромбоцитов.
Лейкоциты, тромбоциты, УФ-излучение, агрегация.
DOI: 10.7868/S0869803114050038
Эффективность применяемого в медицине метода лечения, основанного на введении пациенту его собственной крови, облученной вне организма ультрафиолетовым (УФ) излучением [1, 2], определяется способностью подвергнутых УФ-об-лучению клеток крови оказывать воздействие на нативные, необлученные, клетки. Иными словами, УФ-облученные клетки крови являются триггером, запускающим терапевтический эффект фотомодифицированной крови. Однако характер и причины влияния подвернутых УФ-облучению клеток крови на нативные исследованы недостаточно, хотя анализ такого влияния и его механизмов является значимой как в фундаментальном, так и в прикладном плане, задачей. В доступной литературе не имеется сведений о том, могут ли клетки крови какого-либо типа приобретать после УФ-облучения способность дистантно воздействовать на функции других клеток, в том числе, тромбоцитов. Вместе с тем, известно, что УФ-излучение активирует в клетках крови (тромбоцитах [3] и лейкоцитах [4]) процесс циклооксиге-назного ферментативного окисления полинена-
* Адресат для корреспонденции: 117997 Москва, ул. Островитянова, 1, РНИМУ им. Н.И. Пирогова, каф. общей и медицинской биофизики; тел.: (495) 434-44-74; e-mail: aleksandranosov54@mail.ru.
сыщенных жирных кислот, продукты которого (простагландины и тромбоксаны) отличаются высокой биологической активностью и могут повлиять на функции необлученных клеток. Показано, что активация циклооксигеназного ферментативного окисления полиненасыщенных жирных кислот значима для появления у УФ-об-лученной крови терапевтической активности в отношении модельного перитонита у крыс [5]. Наконец, известно, что УФ-излучение может быть причиной запуска апоптотической гибели клеток. В ходе подготовки к апоптозу клетки высвобождают в среду значительное количество различных соединений, некоторые из которых могут обладать высокой биологической активностью [6]. Соответственно простагландины и тромбок-саны, скорее всего, не являются единственными биологически активными агентами, продуцируемыми УФ-облученными клетками крови. Показано, например, что при подготовке к апоптоти-ческой гибели из клеток вследствие нарушения функции митоходрий и блокирования (поли-АДФ)-рибоза-полимеразы может высвобождаться АДФ [6]. АДФ является активатором тромбоцитов и индуктором их агрегации. Тромбоциты реагируют на него уже при концентрациях этого соединения в среде порядка 10-6 моль/л [7]. В от-
личие от простагландинов и тромбоксанов, АДФ — значительно более стабильное соединение, и может накапливаться в среде инкубации облученных клеток в достаточных для активации тромбоцитов количествах. Исходя из всего вышеизложенного, целью работы было выявление возможного влияния продуцируемых облученными лейкоцитами и накапливающихся в среде относительно стабильных веществ на нативные тромбоциты. Для этого исследовалось влияние среды инкубации облученных УФ-излучением изолированных лейкоцитов на нативные тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы и возможная роль АДФ в этом влиянии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В работе использовали кровь самцов беспородных кроликов весом 2.5—3.5 кг. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы крови (ОТП) кровь из краевой вены уха кролика, стабилизированную 3.8%-ным раствором трехзаме-щенного цитрата натрия, приготовленном на трис-буфере (9 ммоль/л трис, 136 ммоль/л NaCl, 2.7 ммоль/л KCl, pH 7.4; на 1 объемную часть крови добавлялась 0.1 части раствора цитрата в этом буфере), центрифугировали при 460 g в течение 10 мин при комнатной температуре [7]. Суперна-тант (ОТП) использовали в дальнейшей работе после 30 мин инкубации при комнатной температуре.
Суммарную фракцию лейкоцитов выделяли путем дифференциального центрифугирования после осаждения эритроцитов высокомолекулярным декстраном. Для этого к стабилизированной цитратом натрия крови при постоянном перемешивании добавляли 6%-ный раствор декстрана ("Sigma", США, молекулярная масса 500000) в трис-буфере в соотношении 4 : 1 по объему. Полученную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С и 60 мин при комнатной температуре. Су-пернатант отбирали и центрифугировали при 270 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Полученный клеточный осадок ресуспенди-ровали в 0.9 мл бидистиллированной воды в течение 30 с. Затем, путем введения 0.1 мл 10%-ного раствора NaCl и 8 мл трис-буфера, изотоничность среды восстанавливалась. Полученную суспензию клеток еще раз центрифугировали при 460 g в течение 10 мин и комнатной температуре. Надо-садочную жидкость удаляли, а осадок, содержащий лейкоциты, суспендировали в небольшом количестве трис-буфера. Количество выделенных клеток, их выживаемость и морфологический состав оценивали путем прямого светового
микроскопирования в камере Горяева. Концентрация клеток доводилась до 107 клеток/мл (1010 клеток/л). Получаемые препараты лейкоцитов содержали в среднем 65% полиморфноядер-ных лейкоцитов, 25% лимфоцитов и около 10% моноцитов. Примесь клеток других типов была не выше 5%. Выживаемость клеток, определявшаяся по окрашиванию трипановым синим, составляла в среднем 95%. УФ-облучение исследуемых образцов производили при комнатной температуре в пластиковой открытой кювете сверху, при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Толщина облучаемого слоя составляла 0.5 см. В качестве источника излучения применяли бактерицидную ртутную лампу низкого давления БУВ-30П. Интенсивность излучения данного источника в УФ-области, измеренная методом фер-риоксалатной актинометрии [8], составляла 4.9 х 10-5 эйнштейн х м-2 с-1 (32 Вт/м2). Облученную суммарную фракцию лейкоцитов (ОСФЛ) инкубировали в течение 22-24 ч при температуре от 7-9°С. Контрольные образцы лейкоцитов перед такой же инкубацией перемешивали в кювете для облучения без воздействия УФ-излучения. После инкубации образцы центрифугировали при 630 % в течение 30 мин. Супернатант (среда инкубации лейкоцитов) использовали в дальнейшей работе. Агрегацию тромбоцитов регистрировали турбодиметрическим методом Борна [7], при комнатной температуре. Количественным показателем выраженности тромбоцитарной агрегации была выбрана ее скорость, определявшаяся как величина, обратная времени с момента введения индуктора до момента выхода кинетики увеличения светопропускания ОТП на максимум.
Измерение спектров поглощения проводили на спектрофотометре "Весктап DU 720" (США) в кварцевой кювете толщиной 1 см.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе работы исследовали влияние среды инкубации лейкоцитарных клеток на тромбоциты в составе ОТП. Было установлено, что среда, в которой инкубировались подвергнутые УФ-облучению лейкоциты, способна индуцировать агрегацию нативных тромбоцитов кролика в отсутствие иных индукторов: введение в 0.9 мл ОТП 0.1 мл такой среды вызывает увеличение светопропускания образца по характерной для агрегации тромбоцитов кинетике [7]. Вид полученных кинетик был аналогичен тем, которые наблюдаются при индукции агрегации известным индуктором АДФ. Среда, в которой инкубирова-
Таблица 1. Влияние среды инкубации изолированных лейкоцитов кролика на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП)
Введенная в ОТП добавка (01. мл на 09. мл ОТП) Скорость агрегации тромбоцитов*, с-1
Среда инкубации (22—24 ч при 7—9°С) лейкоцитов (107 клеток/мл), облученных в дозе 3 х 10-3 эйнштейн/м2 (1920 Дж/м2) полным спектром излучения ртутно-кварцевой лампы БУВ-30П. 0.090 ± 0.008
Среда инкубации (22—24 ч при 7—9°С) лейкоцитов (107 клеток/мл), подвергнутых перемешиванию в кювете для облучения без воздействия УФ-излучения. 0.004 ± 0.001
Среда инкубации (22—24 ч при 7—9°С) лейкоцитов (107 клеток/мл), облученных в дозе 3 х 10-3 эйнштейн/м2 (1920 Дж/м2) полным спектром излучения ртутно-кварцевой лампы БУВ-30П после термической обработки в течение 5 мин при 100°С. 0.072 ± 0.009
Примечание. * Указаны средняя величина по серии из 5 экспериментов ± отклонение средней.
лись необлученные лейкоциты, агрегации тромбоцитов практически не вызывала. Способность действия среды инкубации облученных лейкоцитов к индукции агрегации нативных тромбоциты зависела от дозы облучения и была максимальна при УФ-облучении лейкоцитов в дозе 3 х 10-3 эйнштейн/м2 (1920 Дж/м2). Значения скоростей агрегации тромбоцитов в ОТП при индукции средами инкубации облученных и необлученных лейкоцитов представлены в табл. 1.
Поскольку известно, что лейкоциты способны высвобождать в определенных условиях достаточно большое число активных соединений с проагрегационным влиянием на тромбоциты, в том числе белки и пептиды [8, 9], в следующей серии экспериментов решено было исследовать роль в наблюдаемом эффекте термо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.