ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 680-685
УДК 581.1:575.222.75:576.535:577.121:582.63.2
ИНДУКЦИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА И ФИТОАЛЕКСИНОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЛУКА (Allium сера) БИОГЕННЫМИ ЭЛИСИТОРАМИ ИЗ ГРИБА Botrytis cinerea
© 2004 г. Г. Ю. Перковская, Ж. Н. Кравчук, Д. М. Гродзинский, Ä. П. Дмитриев
Институт клеточной биологии и генетической инженерии Национальной академии наук Украины, Киев
Поступила в редакцию 11.06.2003 г.
Проведен поиск биогенных элиситоров среди метаболитов фитопатогенного гриба Botrytis cinerea Pers. Найдены и частично очищены три группы элиситоров, которые активно индуцируют защитные реакции в клетках Allium cepa. Показано, что вследствие узнавания элиситорного сигнала в клетках лука увеличивается концентрация активных форм кислорода (АФК) - супероксидного анион-радикала (O'2) и пероксида водорода (Н202). Интенсивность выделения АФК зависела от природы элиситора и его концентрации. Наиболее активно образование АФК клетками лука индуцировала белковая фракция, выделенная из культуральной среды роста гриба. Индуцирующая активность углеводных элиситоров, содержащихся в экстрактах цитоплазмы и клеточных стенок мицелия, оказалась значительно ниже. Динамика генерирования АФК характеризовалась двумя фазами: первой - быстрой и небольшой интенсивности, достигающей максимума через 15 мин после обработки элиситорами, и второй - более продолжительной и мощной, которая наступала через 1.5-6 ч после обработки.
Allium cepa - Botrytis cinerea - фитоиммунитет - защитные реакции - биогенные элиситоры - активные формы кислорода - фитоалексины
Растения постоянно находятся в окружении большого числа патогенных микроорганизмов. Однако они сумели выработать комплекс защитных реакций, например, механическое укрепление клеточных стенок [1], синтез низкомолекулярных антимикробных соединений - фитоалексинов (ФА) [2], образование патоген-зависимых белков (хитиназ, глюканаз) [3] и др. Включение этих реакций происходит после распознавания растениями отдельных метаболитов патогенов - элиситоров. К числу таких биогенных элиситоров относят олигосахариды [4, 5], белки [6], гликопротеины [7] и липиды [8]. Одни элиситоры обнаружены в среде роста патогена [6], другие - в составе его клеточных стенок и цитоплазматическом содер-
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; БФКФ -белковая фракция культурального фильтрата; ДДК - диэ-тилдитиокарбамат натрия; ЛЗХЛ - люцигенин-зависимая
хемилюминесценция; СОД - супероксиддисмутаза; O^ - супероксидный анион-радикал; УФКС - углеводная фракция клеточных стенок; УФЦП - углеводная фракция экстракта цитоплазмы; ФА - фитоалексины; ЦП - цитоплазматичес-кое содержимое мицелия гриба.
Адрес для корреспонденции: Дмитриев Александр Петрович. 03143 Киев, ул. Заболотного, 148. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины. Факс: (38044) 252-17-86; электронная почта: apd@icbge.freenet.kiev.ua
жимом [8]. Однако остается неясным, каким образом распознавание биогенных элиситоров приводит к включению ответных защитных реакций, обуславливающих устойчивость растения к патогену. Поэтому в последние годы интенсивно изучаются ранние реакции растительных клеток на биотический стресс, в том числе изменения ионной проницаемости плазмалеммы и "окислительный взрыв" - генерирование большого количества активных форм кислорода (АФК) [3, 9]. Имеются сведения о том, что АФК могут выступать в роли сигнальных молекул при индукции отдельных защитных реакций у растений [10, 11]. Проверка гипотезы о сигнальной роли АФК при взаимном узнавании в системе патоген-растение требует исследования путей и динамики их образования в ответ на различные элиситоры.
Удобной системой для такого рода экспериментов является культура клеток лука (Allium cepa L.), которая позволяет исследовать ранние реакции на обработку элиситорами, а также моделировать процесс индукции защитных реакций. Как объект исследований лук интересен тем, что относится к числу однодольных растений и имеет полигенную устойчивость. Ранее мы обнаружили ФА у A. cepa и корреляцию между устойчивостью клеток лука к инфицированию и их способностью синтезировать ФА - цибулины 1Д и 2Д [2, 12].
Методами cпeктpальнoгo анализа эти ФА были идeнтифициpoваны как 1.3-диoн-5-oктилциклo-пентан (1Д) и 1.3-диoн-5-гeкcилциклoпeнтан (2Д). В тo же время химическая пpиpoда мeтабoлитoв гpибoв, при взаимoдeйcтвии с кoтopыми у oднo-дoльныx растений включаются защитные реакции, ocraeTCfl малo изyчeннoй.
Cpeди фитопатогенных гpибoв ocoбый интерес представляют грибы poда Botrytis, кoтopыe шиpoкo pаcпpocтpанeны, и нанocят серьезный ущерб ряду ceльcкoxoзяйcтвeнныx культур, oco-бeннo oвoщным и плoдoвo-ягoдным культурам, гибель ypoжая кoтopыx дocтигаeт 45-60 %. Cpeди них выделяют виды типа Botrytis cinerea, неспеци-фичecкoгo пoлифага, пopажающeгo шиpoкий круг растений-тозяев ^o 200 видoв), и виды, спе-циализиpoванныe к cвoим тозяевам, как, например, Botrytis allii, пopажающий лук при хранении [13]. Ранее мы пoказали вoзмoжнocть индyциpo-вания синтеза ФА у A. cepa в oтвeт на oбpабoткy биoгeнными элиcитopами, выделенными из спе-цифичecкoгo патoгeна B. allii [14].
Цель настоящей pабoты cocтoяла в том, чтобы иcпoльзyя ФА лука как маркеры индyциpoваннoй ycтoйчивocти, пpoвecти пoиcк биoгeнныx элиси-тopoв среди мeтабoлитoв B. cinerea и изучить динамику oбpазoвания киcлopoдныx pадикалoв -
O2 и H202 в cycпeнзиoннoй культуре клeтoк A. cepa в oтвeт на oбpабoткy разными элиситорами.
МЕТОДИКА
Cycпeнзиoннyю культуру клeтoк лука репчатого (Allium cepa L.) горта ^Биржий пoлyчали из каллycнoй ткани и выращивали на среде BDS [15], coдepжащeй 3 мг/л 2.4-Д и 0.6 мг/л кинетина [16].
^льтура нeкpoтpoфнoгo фитoпатoгeннoгo гриба Botrytis cinerea Fers., штамм 2307, была пo-лучена из ^ллекции Института микpoбиoлoгии и виpycoлoгии им. Д.^ Забoлoтнoгo HAH Украины. ^льтуру гриба выращивали в течение 10 сут на жид^й среде Чапека.
Беловую фракцию кyльтypальнoгo фильтрата (БФKФ-элиcитop) пoлyчали из среды pocra па-тoгeна ocаждeниeм бел^в cyльфатoм аммoния (10-80%) с пocлeдyющим диализoм [14]. Углeвoд-ную фракцию цитоплазмы (УФЦП-элиситор) и клeтoчныx cтeнoк (УФKC-элиcитop) пoлyчали из мицелия B. cinerea. Для извлечения из мицелия цитоплазматических yглeвoдoв иcпoльзoва-ли CToco6 экстракции, пpeдлoжeнный Wang, Bartnicki-Garcia [17] в мoдификации Чалoвoй и др. [18]. Для этого мицелий мнoгoкpатнo пpoмывали, а затем пpoвoдили экстракцию 70%-ным этилo-вым cпиpтoм (1 г cыpoгo веса/10 мл) при 100°C в течение 20 мин. Cпиpтoвoй экстракт центрифуги-poвали (1000 g, 5 мин). &ирт удаляли в poтopнoм
испарителе, а ocтавшийcя pаcтвop (экстракт цито-плазматичecкoгo coдepжимoгo мицелия гриба -ЦП) вдвoe разбавляли вoдoй, диализoвали и пpo-пускали через кoлoнкy с Sephadex G-75 для пoлy-чения oчищeнныx бeлкoвoй и yглeвoднoй фракции ЦП. 0cтатoк мицелия пocлe экcтpагиpoвания cпиpтoм иcпoльзoвали для пoлyчeния препарата клeтoчныx cтeнoк и извлечения из него индуцирующего начала пo методу Чалoвoй и др. [7]. Для этого его пoдвepгали действию ультразвука (12 мин) на ycтанoвкe UD-20 ("Techpan", Пoльша). Пocлe этoгo нecкoлькo раз пpoвoдили экстракцию клeтoчныx cтeнoк вoдoй, экстракт центри-фyгиpoвали. Затем препарат пpoмывали на фильтре сначала смесью xлopoфopм i мeтилoвый спирт (2 i 1), пoтoм ацeтoнoм и эфиpoм (для удаления липиднoй cocтавляющeй), высушивали на вoздyxe и иcпoльзoвали для пoлyчeния элиcитopа. УфKC-элиcитop пoлyчали щeлoчным гидpoли-зoм (1 N NaOH) препарата клeтoчныx cтeнoк в течение 24 ч (10 мг сутой массы препарата клеточных cтeнoк/мл экстрагента) с пocлeдyющeй нейтрализацией и диализoм. Coдepжаниe oбщeгo белка и yглeвoдoв в различных фракциях мeтабo-литов патoгeна oпpeдeляли, cooтвeтcтвeннo, пo Lowry [19] и фeнoл-cepным мeтoдoм [20]. В качестве стандарта при oпpeдeлeнии белка иcпoльзo-вали бычий cывopoтoчный альбумин ("Sigma", CШA). Koличecтвo yглeвoдoв bo фракциях элиси-TOpoB выражали в эквивалентных кoличecтваx глюкoзы.
Для экcпepимeнтoв пo индyциpoванию синтеза ФА 300 мг cыpoй массы клеток 10-днeвнoй сус-пeнзиoннoй культуры A. cepa pecycпeндиpoвали в 20 мл раст^ра А, coдepжащeгo 1 мМ CаCl2, 0.1 мМ KCl, 0.1 мМ MgCl2, 1 мМ MES и 30 г/л саха-poзы, pH 5.6, и oбpабатывали элиcитopами. Экстракцию ФА из суспензии клеток пpoвoдили через 48 ч пocлe индукции. Из кyльтypальнoй среды ФА экcтpагиpoвали эфиpoм (30 мл эфира/10 мл среды), а из клeтoчнoй массы - бeнзoлoм (20 мл бeнзoла/г cыpoй массы клеток). Экстракцию пpoвoдили на пpoтяжeнии 24 ч при 4°C. ^том фракцию нeпo-лярных pаcтвopитeлeй упаривали дocyxа в poTOp-нoм испарителе и сутой ocтатoк pаcтвopяли в смеси гексан i эфир (3i1). Удержание ФА анализи-poвали мeтoдoм ВЭЖХ на пpибope HPC (Чехия) с пpямoфазнoй аналитичecкoй кoлoнкoй Sepharon SGX (Чехия). Элюцию пpoвoдили смесью гексан i диэтилoвый эфир (3 i 1) [12]. Пики 1Д и 2Д цибу-линoв peгиcтpиpoвали при 254 нм. Cyммаpнoe толи-чecтвo ФА 1Д и 2Д рассчитывали в oтнocитeльныx единицах на единицу cыpoй массы клеток, истодя из суммы плoщадeй cooтвeтcтвyющиx пикoв [2].
Для экcпepимeнтoв пo индyциpoванию AФK клетки 10-днeвнoй cycпeнзиoннoй культуры ocаждали цeнтpифyгиpoваниeм (100 g, 5 мин), o^ мывали и pecycпeндиpoвали в pаcтвope А из расчета 0.6 г cыpoй массы клеток на 10 мл раст^ра.
ФА-индуцирующая активность различных метаболитов гриба Botrytis cinerea
Элиситор Концентрация элиситора, мкг/мл Количество ФА, отн. ед./г сырой массы
Контроль - 5.17 ± 3.2
Культуральный фильтрат 5 мкг белка/мл 23.2 ± 1.3
БФКФ 25 мкг белка/мл 46.4 ± 1.5
10 22.0 ± 3.8
50 55.6 ± 5.0
100 60.1 ± 2.7
УФКС 5 17.3 ± 0.7
25 33.6 ± 3.8
50 58.2 ± 3.9
ЦП 10 мкг-экв. глюкозы/мл 16.0 ± 1.2
50 31.4 ± 2.6
100 57.9 ± 1.6
УФЦП 10 23.2 ± 2.5
25 33.3 ± 3.7
50 47.4 ± 3.9
Образование супероксидного анион-радикала
(O2) в клетках лука определяли хемилюминес-центным методом с использованием люцигенина [21]. После добавления элиситоров к суспензии клеток отбирали в различное время аликвоты и обрабатывали 1 мМ ^^диэтилдитиокарбама-том натрия (ДДК, ингибитором Си2+/2п2+-супер-оксиддисмутазы (СОД) [22]) для предотвращен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.