БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 6, с. 724 - 731
УДК 577.121.7
ИНДУКЦИЯ а,ю-ГЕКСДЦЕКАНДИОЛОВОЙ КИСЛОТОЙ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМОЙ ЦИКЛОСПОРИН А-НЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ И ОСВОБОЖДЕНИЯ ЦИТОХРОМА с В СРЕДАХ РАЗЛИЧНОЙ ИОННОЙ СИЛЫ
© 2014 М.В. Дубинин, А.А. Ведерников, Е.И. Хорошавина, В.Н. Самарцев*
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс: (836-2)56-5781, электронная почта: samvic56@mail.ru
Поступила в редакцию 19.02.14 После доработки 26.02.14
В митохондриях печени, нагруженных Ca2+ или Sr2+, а,ю-гексадекандиоловая кислота (ГДК) способна индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны (митохондриальную пору) по нечувствительному к циклоспорину А (ЦсА) механизму. Изучено влияние ионной силы среды инкубации на кинетику процессов, сопровождающих Са2+-зависимую индукцию жирной кислотой митохондриальной поры: набухание органелл, выход Са2+ из матрикса, изменения трансмембранного потенциала (Ау) и скорости потребления кислорода, а также освобождение цитохрома с из межмембранного пространства. Использованы две базовых среды инкубации: сахарозная и изотоническая ионная среда, содержащая KCl без сахарозы. Установлено, что 200 мкМ Са2+ и 20 мкМ ГДК в присутствии ЦсА эффективно индуцируют высокоамплитудное набухание митохондрий печени как в сахарозной, так и в ионной средах инкубации. Митохондрии, инкубируемые в сахарозной среде в присутствии ЦсА, способны быстро поглощать Са2+ и некоторое время удерживать его в матриксе без снижения Ау. При инкубации в ионной среде митохондрии недолго удерживают большую часть добавленного Са2+ в матриксе без снижения Ау. В обоих случаях добавление к митохондриям ГДК через 2 мин после внесения Са2+ приводит к быстрому выходу этих ионов из матрикса и полному падению Ау. Индуцированное Са2+ и ГДК набухание митохондрий в неионной среде сопровождается стимуляцией дыхания органелл почти до максимального уровня. В тех же условиях, но при инкубации митохондрий в ионной среде для существенной стимуляции дыхания необходимо добавить цито-хром с. Индуцированное Са2+ и ГДК набухание митохондрий приводит к большему освобождению цито-хрома с при условии инкубации их в ионной среде, нежели в сахарозной среде. Сделан вывод о том, что высокая ионная сила среды инкубации определяет массивный выход цитохрома с из митохондрий и предполагает его освобождение из дыхательной цепи, что приводит к блокаде транспорта электронов по дыхательной цепи и, следовательно, к нарушению энергетических функций органелл.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрии печени, а,ю-гексадекандиоловая кислота, циклоспорин А-нечувстви-тельная проницаемость, Са2+, цитохром с.
Митохондрии не только обеспечивают клетку АТР и теплом, но и участвуют в гибели клеток по механизмам апоптоза и некроза [1—5]. Очевидно, что гибель большого количества клеток жизненно важных органов может привести к нарушению их функции, это, в свою очередь, может быть причи-
Принятые сокращения: ГДК — а,ю-гексадекандио-ловая кислота, ЦсА — циклоспорин А, ТФФ+ — катион тет-рафенилфосфония, Ау — трансмембранный электрический потенциал.
* Адресат для корреспонденции.
ной гибели всего организма [1, 4, 5]. В качестве одного из связанных с митохондриями звеньев гибели клеток рассматривается индукция Са2+-за-висимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны для растворимых в воде веществ с молекулярной массой до 1500 Да (открытие митохондриальной поры) [1, 3, 6, 7]. Образование такой поры может приводить к набуханию матрикса митохондрий, разрыву внешней мембраны и вследствие этого к выходу находящихся в межмембранном пространстве различных белков, в том числе и цитохрома с [1, 3, 6—8].
Цитохром с — водорастворимый белок молекулярной массой около 12 кДа, являющийся одним из компонентов дыхательной цепи, локализован в межмембранном пространстве митохондрий [1]. Наибольшая фракция цитохрома с, составляющая -85% этого белка, находится в пространстве между кристами внутренней мембраны. Цитохром с этой фракции путем электростатических и гидрофобных взаимодействий прочно связан с липидами внутренней мембраны митохондрий (преимущественно с кардиолипином), в то время как цитохром с меньшей фракции свободно диффундирует в пределах межмембранного пространства [3, 7, 8]. Такое распределение этого белка, как полагают, связано с тем, что наибольшее количество комплексов дыхательной цепи митохондрий сконцентрировано именно в мембранах крист [9]. Выше уже отмечалось, что одним из путей освобождения существенного количества цитохрома с из митохондрий печени может являться индукция Са2+-за-висимой поры. В этом случае набухание мат-рикса митохондрий приводит к разрыву внешней мембраны и вследствие этого быстрому выходу свободно диффундирующего в межмембранном пространстве цитохрома с, а затем, по мере вызванного набуханием расправления крист и из той фракции, которая связана с крис-тами [7, 8, 10—12]. Связанный с кардиолипином цитохром с может быть мобилизован путем разрыва электростатических взаимодействий при повышении ионной силы среды инкубации, а также при окислении кардиолипина активными формами кислорода [8, 10]. Освобождение больших количеств цитохрома с из митохондрий приводит к практически полной блокаде транспорта электронов по дыхательной цепи [13]. Другой путь освобождения цитохрома с из митохондрий реализуется при участии белков семейства Вс1-2 в отсутствие Са2+ и не сопровождается набуханием митохондрий и разрывом внешней мембраны [12].
Эффективными индукторами Са2+-зависи-мой поры являются свободные монокарбоновые жирные кислоты [14—19]. В рамках механизма «классической» индукции поры предполагается, что жирные кислоты взаимодействуют с одним из модуляторов порового комплекса — ADP/ATP антипортером (другое название адениннуклео-тидтранслоказа). В этом случае эффект жирных кислот проявляется только в присутствии ионов кальция (другие двухвалентные катионы не эффективны) и подавляется специфическим бло-катором «классической» поры циклоспорином А (ЦсА) [14, 15]. В отличие от этого, индукция поры пальмитиновой и другими предельными жирными кислотами не подавляется ЦсА, и для
индукции этой «неклассической» поры Са2+ может быть заменен ионами других двухвалентных металлов, например, 8г2+ [16—19]. Предположено, что такая ЦсА-нечувствительная пора имеет липидную природу [18—19].
Одним из путей метаболизма свободных длинноцепочечных монокарбоновых жирных кислот в клетках печени является их ю-окисле-ние при участии микросомальных ферментов [20—22]. В результате этого образуются длинно-цепочечные а,ю-диоловые (дикарбоновые) жирные кислоты, отличающиеся от монокарбоно-вых жирных кислот наличием второй карбоксильной группы в ю-положении, т.е. на противоположном конце ацильной цепи [20—22]. В нормальных физиологических условиях ю-окис-ление жирных кислот в клетках печени не превышает 10% от их общего метаболизма и рассматривается как минорный метаболический путь [20—22]. Однако известно немало патологических состояний, сопровождающихся значительным повышением свободных жирных кислот в клетках, межклеточных средах и в сыворотке крови [2]. В этих условиях недостаточная активность основного пути метаболизма жирных кислот, главным образом в-окисления в митохондриях, приводит к значительному усилению их ю-окисления и, следовательно, к увеличению содержания а,ю-диоловых кислот [21, 22]. Хорошо известен синдром Рея у детей, который характеризуется острой энцефалопатией и жировой инфильтрацией печени и при котором концентрация длинноцепочечных а,ю-дио-ловых кислот в сыворотке крови может достигать 0,5 мМ [23]. Показано, что ю-окисление свободных жирных кислот в клетках печени также значительно усиливается под влиянием некоторых ксенобиотиков и при хроническом действии этанола [24, 25].
Недавно нами было установлено, что в митохондриях печени, нагруженных Са2+ или 8г2+, длинноцепочечные а,ю-диоловые кислоты в сахарозной среде способны индуцировать открытие «неклассической» поры по механизму, нечувствительному к ЦсА, также эффективно, как это делают предельные монокарбоновые жирные кислоты пальмитиновая и миристиновая [26]. Наибольшей эффективностью среди а,ю-диоловых кислот обладает а,ю-гексадекандио-ловая кислота (ГДК), способная индуцировать неспецифическую проницаемость в максимальной степени уже в концентрации 20 мкМ (20 нмоль на 1 мг белка митохондрий) при концентрации Са2+ 50 мкМ [26]. Предположено, что накопление а,ю-диоловых кислот в клетках печени при различных патологических состояниях, связанных с нарушением метаболизма липидов, явля-
ется одним из факторов их гибели путем индукции Са2+-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны [26].
В настоящей работе предполагалось выяснить: 1) как изменится кинетика процессов, сопровождающих индукцию проницаемости митохондрий печени ГДК и Са2+ (набухание ор-ганелл, выход Са2+ из матрикса, изменение Лу и скорости потребления кислорода) при замене сахарозной среды инкубации на среду инкубации с высокой ионной силой, составленную на основе хлорида калия; 2) как зависит индуцированное освобождение цитохрома с из митохондрий печени от ионной силы среды инкубации в случае генерации митохондриальной поры, вызванной Са2+ и ГДК.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Митохондрии из печени белых половозрелых крыс-самцов массой 210—250 г выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью БСА в соответствии с описанной ранее методикой [27]. Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA, 5 мМ MOPS-Tris, рН 7,4. Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали раствор БСА. Во время проведения эксперимента суспензию митохондрий (60—70 мг митохондриального белка в 1 мл) хранили на льду в узкой пластиковой пробирке.
Набухание митохондрий регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий (А) при длине волны 540 нм как подробно описано ранее [26]. Скорость набухания митохондрий определяли как изменени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.