РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2009, том 49, № 1, с. 42-45
АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ
УДК 577.122: 577.123:612.112.94:614.876
ИНДУКЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ОБЛУЧЕННЫХ В АДАПТИРУЮЩЕЙ ДОЗЕ
© 2009 г. А. Н. Осипов*, Е. Ю. Лизунова, Н. Ю. Воробьева, И. И. Пелевина
Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва
Методом ДНК-комет было показано, что облучение в малой адаптирующей дозе (5 сГр) лимфоцитов крови человека в стадии G1 клеточного цикла индуцирует адаптивный ответ (АО), проявляющийся в снижении индукции двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК) проявляющим облучением в дозе 10 Гр. Через 24 ч после адаптирующего облучения (48 ч после добавления ФГА) в облученных в адаптирующей и проявляющих дозах клетках относительное количество ДР ДНК меньше на ~ 24% по сравнению с контролем, облученным только в проявляющей дозе. Через 48 ч после адаптирующего облучения этот показатель увеличивается до ~ 35%, а через 72 ч снижается до ~ 29%. Наблюдаемый нами в течение 72 ч после его инициации AO не сопровождается статистически достоверным изменением эффективности репарации ДР ДНК. Можно полагать, что основную роль в формировании АО в лимфоцитах, при использованных условиях эксперимента, играют процессы, предотвращающие образование радиоиндуцированных ДР ДНК (активизация систем антиокси-дантной защиты, изменения конформации хроматина и т.д.).
Метод ДНК-комет, двунитевые разрывы ДНК, лимфоциты, адаптивный ответ.
Феномен уменьшения клеточной чувствительности к воздействию ионизирующего излучения в больших дозах после облучения клеток в малых дозах, получивший название радиационно-инду-цированного адаптивного ответа (АО), изучается уже третье десятилетие. С момента первого описания этого феномена 01тей й а1. [1], проводивших эксперименты на лимфоцитах крови человека, появилось множество доказательств существования АО как на клеточном уровне, так и на уровне организма [2]. Считается, что ключевую роль в развитии АО играют активизация процессов репарации ДНК [3], систем антиоксидантной защиты [4], изменения длительности клеточного цикла [5] и гибель наиболее радиочувствительных клеток по апоптотическому механизму [6]. В инициации и формировании АО участвуют различные сигнальные пути, в которые вовлечены целый ряд белков, в частности поли (АДФ-рибозо) полимераза, р53, протеинкиназа С (РКС), р38 ми-тоген активирующая протеинкиназа (р38МАРК), фосфолипаза 81, кластерин и др. [7, 8]. Однако до сих пор нет четких представлений о том, какой из вышеупомянутых механизмов АО является ведущим, особенно в последующих поколениях облученных клеток. Непростая ситуация сложилась вокруг таких критических для клетки повреждений ДНК, как двунитевые разрывы (ДР ДНК).
* Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ул. Косыгина, 4, ИХФ РАН; тел.: (495) 939-74-47; факс: (495) 65121-91; e-mail: andreyan.osipov@rambler.ru
Это связано со сравнительно небольшим количественным выходом ДР ДНК на единицу дозы облучения (~40 ДР ДНК на клетку при облучении в дозе 1 Гр [9]), что требует для их анализа специальных методических подходов. Как правило, при изучении АО используются цитогенетические методы, регистрирующие нарушения, вызванные неотрепарированными ДР ДНК, и не дающие ответ на вопрос о механизмах снижения доли клеток с этими нарушениями.
Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы было изучение влияния облучения в адаптирующей дозе на изменения чувствительности делящихся в течение нескольких поколений лимфоцитов крови человека к воздействию дополнительного облучения, оцениваемой по уровня ДР ДНК и эффективности их репарации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов из гепаринизирован-ной крови человека проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фикол-верографин ("Histopaque", Sigma) в соответствии с прилагаемой инструкцией. После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в среде RPMI-1640 (фирма "Панэко") до конечной концентрации 1-2 х 106 клеток/мл.
Стимулированные к пролиферации фитогемо-агглютинином (ФГА, 7 мкг/мл) лимфоциты культивировали в термостате при 37°С в полной среде
RPMI-1640, содержащей 20% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики в течение 2496 ч (все реактивы фирмы "Панэко").
Облучение клеток проводили на установке "Алтай" (Россия, источник гамма-излучения 60Co) при мощности дозы 1 Гр/мин и температуре 4°C. Для определения первичного уровня ДР ДНК, индуцированных проявляющим облучением в дозе 10 Гр, облучали агарозные слайды с иммобилизи-рованными в них клетками. Этот методический подход позволяет сократить время между окончанием облучения и лизисом клеток до 30-60 с.
Уровень двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов через 30-60 с (4°C) и через 1 ч после облучения (1 ч инкубация клеток при 37°С в полной среде RPMI 1640) определяли модифицированным методом электрофореза ДНК единичных клеток при нейтральной рН (метод ДНК-комет, "нейтральная" версия) [10]. Степень фрагментирован-ности двунитевой ДНК, определяемая этим методом, оценивается по увеличению количества мигрировавшей из ядерной области двунитевой ДНК и расстояния ее миграции после проведения электрофореза ДНК иммобилизованных в агаро-зу единичных клеток.
Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый "Sigma" (2 мкг/мл в фосфатно-соле-вом буфере, рН 7.4). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью микроскопа Люмам P-8 (ЛОМО, Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений "Микмед-1600-3ф" (ОМО, Россия). Для анализа ДНК-комет использовали программу CometScore v. 1.5 (TriTek Corp. http://tritekcorp.com). Оценивали момент хвоста ДНК-комет (Оливе момент хвоста) равный произведению расстояния от центра ядра до центра плотности хвоста кометы на % ДНК в хвосте.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. Результаты исследований представлены как среднее четырех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. Для оценки достоверности различий использовали i-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, АО зависит от индивидуальных генетических особенностей организма, возраста и может быть модифицирован воздействиями, связанными с образом жизни, профессией, окружающей средой [11]. Поэтому для того, чтобы избежать неопределенности, связанной с индивидуальной вариабельностью проявления АО, в наших исследованиях использовали кровь только тех здоровых доноров, для лимфоцитов которых было ранее, с помощью стандартных цитогенети-ческих тестов, показано наличие достоверного АО.
Крайне важно было также выбрать оптимальную адаптирующую дозу и стадию клеточного цикла, на которой будет проведено облучение. Анализ данных литературы и результатов собственных исследований показал, что хотя диапазон адаптирующих доз довольно широк (от 1 до 20 сГр), наиболее часто для индукции АО в лимфоцитах используют дозы 2-5 сГр [11-13]. С другой стороны, накоплено много данных, что АО наблюдается при облучении лимфоцитов в адаптирующей дозе через 20-24 ч после их стимуляции к делению, то есть в стадии 01 клеточного цикла [11-13]. Основываясь на этих данных, для индукции АО мы выбрали адаптирующую дозу 5 сГр с облучением клеток через 24 ч после их стимуляции к делению ФГА. В качестве проявляющей дозы была выбрана доза 10 Гр, что обусловлено относительно невысоким количественным выходом ДР ДНК (см. введение).
Результаты наших исследований показали, что облучение культивируемых лимфоцитов в дозе 5 сГр через 24 ч после добавления ФГА приводит к статистически достоверному (р < 0.05) снижению выхода ДР ДНК, индуцированных дополнительным облучением в дозе 10 Гр, через 24, 48 и 72 ч после адаптирующего облучения (рис. 1). Расчеты свидетельствуют, что через 24 ч после адаптирующего облучения (48 ч после добавления ФГА) в облученных в адаптирующей дозе клетках относительное количество индуцированных облучением в проявляющей дозе ДР ДНК меньше на ~ 24%, чем при облучении контрольных клеток только в проявляющей дозе. Через 48 ч после адаптирующего облучения (72 ч после добавления ФГА) этот показатель увеличивается до ~ 35%, а через 72 ч (96 ч после добавления ФГА) опять снижается до ~ 29%.
Для изучения эффективности репарации ДР ДНК в поколениях адаптированных и контрольных клеток лимфоциты после дополнительного облучения в дозе 10 Гр инкубировали в течение 1 ч. Согласно данным литературы, с помощью метода ДНК-комет за это время в лимфоцитах происходит репарация ~ 50-60% ДР ДНК путем негомологичного воссоединения [14]. Результаты, представленные на рис. 2, свидетельствуют, что развитие АО в делящихся лимфоцитах в течение 24-72 ч после облучения в адаптирующей дозе (48-96 ч после добавления ФГА) не сопровождается статистически достоверным увеличением эффективности репарации ДР ДНК путем негомологичного воссоединения. Возможно, что инициация АО приводит в основном к активизации более медленной, но корректной репарации ДР ДНК путем гомологичной рекомбинации. Однако проверить эту гипотезу в настоящее время на лимфоцитах крови не представляется возможным, так как через 4-6 ч после облучения в дозах, индуцирующих достаточное для анализа количе-
44
ОСИПОВ и др.
Момент хвоста, усл. ед. 140
120 100 80 60 40 20 0
Ь' Контроль н 5 сГр на 24 ч м 10 Гр
м 5 сГр на 24 ч + 10 Гр
48 72
Время после добавления ФГА, ч
96
Рис. 1. Уровень двунитевых разрывов ДНК (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.), индуцированных проявляющим облучением в дозе 10 Гр, в адаптированных (облучение в дозе 5 сГр на 24 ч) и контрольных делящихся лимфоцитах в различное время после стимуляции клеток к делению.
* Различие эффекта проявляющего облучения в дозе 10 Гр в адаптированных и контрольных клетках достоверно при р < 0.05.
% неотрепарированных ДР ДНК 70
60 50 40 30 20 10 0
Контроль 5 сГр на 24 ч
48 72
Время после добавления ФГА, ч
96
Рис. 2. Эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК, индуцированных проявляющим облучением в дозе 10 Гр, в адаптированных (облучение в дозе 5 сГр на 24 ч) и контрольных делящихся лимфоцитах в различное время после стимуляции клеток к делению.
ство ДР ДНК,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.