научная статья по теме ИНДУКЦИЯ РЕДКО- И ПЛОТНОИОНИЗИРУЩИМИ ИЗЛУЧЕНИЯМИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ПОЛИХРОМАТОФИЛЬНЫХ ЭРИТРОЦИТАХ КОСТНОГО МОЗГА МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМКОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ИНДУКЦИЯ РЕДКО- И ПЛОТНОИОНИЗИРУЩИМИ ИЗЛУЧЕНИЯМИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ПОЛИХРОМАТОФИЛЬНЫХ ЭРИТРОЦИТАХ КОСТНОГО МОЗГА МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМКОВ»

= РАДИАЦИОННАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА =

УДК [57+61]::539.1.04:599.323.4:591.111.1:611.018.46:575:614.876:57.085.1

ИНДУКЦИЯ РЕДКО- И ПЛОТНОИОНИЗИРУЩИМИ ИЗЛУЧЕНИЯМИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ПОЛИХРОМАТОФИЛЬНЫХ ЭРИТРОЦИТАХ КОСТНОГО МОЗГА МЫШЕЙ И ИХ ПОТОМКОВ

© 2014 г. Е. А. Кузнецова, С. И. Заичкина, Н. П. Сирота*, С. А. Абдуллаев, О. М. Розанова, Г. Ф. Аптикаева, С. С. Сорокина, С. П. Романченко, Е. Н. Смирнова

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

Цель настоящей работы заключалась в исследовании реакции кроветворной системы в разные сроки после воздействия редко- и плотноионизирующего излучений у мышей и их необлученных потомков на молекулярном и клеточном уровнях. Повреждение генома после воздействия острого рентгеновского излучения оценивали на молекулярном уровне с помощью комета-теста в лейкоцитах крови, а после воздействия низкоинтенсивного плотноионизирующего излучения (НПИ) как на молекулярном, так и клеточном уровне — микроядерным тестом в клетках костного мозга. Для оценки уровня повреждений ДНК в лейкоцитах крови кроме количества ДНК в хвосте "кометы" использовали дополнительные параметры — доли лейкоцитов с неповрежденной и высокофрагмен-тированной ДНК, которые позволяют обнаружить изменения, характеризующие динамику популяции лейкоцитов в разные сроки после воздействия. Было обнаружено: увеличение повреждений ДНК в зависимости от дозы НПИ, отсутствие различий в уровнях повреждений ДНК у потомков облученных (НПИ) и необлученных животных как на молекулярном, так и на цитогенетическом уровнях; уменьшение радиочувствительности потомков мышей, подвергшихся воздействию НПИ в дозе 0.35 Гр, что выявлено только на молекулярном уровне и может свидетельствовать о возможности трансгенерационной передачи повреждений генома.

Рентгеновское излучение, плотноионизирующее излучение, повреждения ДНК, метод "комета-тест", микроядра, мыши.

БОТ: 10.7868/80869803114040080

Расширение сферы контактов людей с источниками ионизирующего излучения (ИИ), заметное повышение радиационного фона Земли в последние несколько десятилетий в результате техногенных катастроф сделали актуальным всестороннее изучение последствий воздействия ИИ в малых дозах на живые организмы. Кроме того, осуществление околоземных и проектирование межпланетных полетов поставили новую научно-практическую задачу обеспечения радиационной безопасности летчиков и космонавтов [1]. Последствия воздействий на человека при высотных полетах изучены недостаточно, что связано с уникальностью полей излучения, генерируемых космическими лучами, которые состоят из нескольких типов радиации и частиц, характеризующихся различными значениями ЛПЭ. Накопленные экспериментальные данные по исследованию биологического действия ИИ в ма-

* Адресат для корреспонденции: 142290 Пущино, Московская обл., ИТЭБ РАН; тел.: (4967) 73-92-34; факс: (4967) 33-05-53; e-mail: sirota@iteb.ru.

лых дозах с высокими значениями ЛПЭ на летчиков и космонавтов, в основном, получены при обследовании этого контингента лиц после полетов. Другой способ получения подобных результатов — моделирование условий облучения при полетах на высокоэнергетических ускорителях [2—5]. Система кроветворения является одной из наиболее радиочувствительных и изучение пострадиационных гематологических показателей важно для оценки длительного влияния ИИ на здоровье человека. Современные методы позволяют оценить результаты воздействия ИИ на клетки живых организмов как на молекулярном (комета-тест), так и на клеточном (МЯ-тест) уровнях. Микроядерный тест представляется чувствительным общепринятым методом для мониторирования последствий воздействия различных факторов в малых дозах и концентрациях. Комета-тест в последнее время многие исследователи также используют в качестве мониторингового для оценки влияния различных физико-химических факторов на геном клеток разных тканей человека

[6—8]. Показано соответствие результатов, полученных комета-тестом, уровню цитогенетиче-ских повреждений при воздействии у-, Х-излуче-ния и быстрых нейтронов [9]. Имеются единичные работы по оценке этим методом уровня повреждений ДНК в лейкоцитах периферической крови in vivo при длительном воздействии ИИ в малых дозах с высокими значениями ЛПЭ на живой организм [3, 10]. Изучение повреждений генома на молекулярном и клеточном уровнях в лейкоцитах периферической крови и клетках костного мозга у мышей в отдаленные сроки после облучения может дать более полную картину реакции кроветворной системы на воздействия ИИ с разными значениями ЛПЭ.

В связи с изложенным, цель нашей работы заключалась в исследовании реакции кроветворной системы у мышей, подвергшихся воздействию редко- и плотноионизирующего излучений, и у их необлученных потомков с помощью микроядерного и комета-тестов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Животные. В экспериментах использовали 2-месячных самцов мышей неинбредной линии SHK массой 22—25 г, которых содержали в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН.

Воздействие редкоионизирующего излучения. Мышей подвергали воздействию рентгеновского излучения на установке "РУТ-250-15-1" (Россия) при мощности дозы 1.12 Гр/мин, напряжении 200 кВ, силе тока 20 мА; фильтры 1 мм Al и 1 мм Cu, фокусное расстояние 37 см.

Воздействие плотноионизирующего излучения. Мышей круглосуточно подвергали воздействию низкоинтенсивного плотноионизирующего излучения (НПИ) за верхней бетонной защитой Серпуховского ускорителя протонов с энергией 70 ГэВ (У-70 ИФВЭ, Протвино), спектральный и компонентный состав которого был подобен таковому в атмосфере на высоте примерно 10 км [2, 3]. Мониторирование облучения проводили нейтронным детектором системы радиационного контроля ускорителя У-70, измеряющим эквивалентную дозу нейтронов с энергией до 20 МэВ, и термолюминесцентными дозиметрами ИКС, измеряющими поглощенную дозу фотонов и протонов. По компонентному составу доза нейтронов с энергией до 20 МэВ в точке измерения составляет половину полной дозы нейтронов с энергией от тепловой и до 500 МэВ. Спектр нейтронов, измеренный за верхней бетонной защитой ускорителя с помощью спектрометра Боннера в точке измерения РМ58 и равновесный спектр протонов, из-

меренный там же, представлены в работе [2]. Средняя энергия спектра нейтронов составляла 40 МэВ. Нейтронные спектры за верхней бетонной защитой ускорителя похожи на спектры нейтронов, формируемые космическими лучами на высоте от 3 до 12 км [2]. Многозарядных ионов за бетонной защитой практически нет.

При средней мощности дозы 0.01 Гр/сут животные получили 0.14 и 0.35 Гр. Различия в среднем значении мощности дозы в разных сериях экспериментов не превышали 20%.

Через 24 ч после завершения облучения за верхней бетонной защитой половину мышей подвергали дополнительному воздействию рентгеновского излучения в дозе 1.5 Гр.

Через 28 ч после всех видов облучения животных обездвиживали методом цервикальной дислокации. Эксперименты на животных проводили согласно рекомендациям Комиссии по биомедицинской этике в ИТЭБ РАН.

Получение потомков F1. Для получения потомства через 15 сут после окончания облучения за верхней бетонной защитой ускорителя протонов самцов спаривали с необлученными самками в течение 2 нед. Полученных самцов-потомков (F1) использовали в эксперименте в возрасте 2 мес.

Микроядерный тест. Для определения уровня цитогенетических повреждений готовили цитологические препараты костного мозга по стандартной методике и подсчитывали количество полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами (МЯ) [2, 11]. На каждую экспериментальную точку использовали не менее 5 мышей, с каждого препарата анализировали по 3000 ПХЭ.

Метод "комета-тест". Предметные стекла погружали в раствор 1%-ной агарозы и высушивали. На эти стекла наносили слой 1%-ной агарозы и охлаждали до затвердевания. Для приготовления слайдов были отобраны аликвоты (10 мкл) крови, полученной при надрезании кончика хвоста. Кровь отбирали в пробирки с 40 мкл фосфатного буфера (ФБ), рН 7.2, содержащего 0.001 моль/л ЭДТА (ФБ-ЭДТА). Аликвоты разведенной крови смешивали с равным объемом 1%-ной легкоплавкой агарозы ("Sigma Chem. Co.", США) при температуре 37°С и наносили на приготовленный агарозный слой. После застывания агарозы, содержащей клетки, сверху наносили новый слой 0.5%-ной легкоплавкой агарозы. Слайды помещали в лизирующий раствор (2.5 моль/л ШС1, 0.1 моль/л эДтА, 0.01 моль/л трис-НС1, рН 10, 1% Тритон Х-100) при 4-6°С на 1 ч. Затем слайды перемещали на 20 мин в щелочной раствор "А" (0.3 моль/л №ОН, 0.001 моль/л ЭДТА, рН > 13), переносили в электрофоретиче-

скую камеру SE-1/S-1N (ООО "Компания Хели-кон", Россия) и подвергали электрофорезу в растворе "А" (250 мл) в течение 20 мин при 4—6°С (напряжение 27 В, сила тока 260—270 мА, напряженность электрического поля 2 В/см). После электрофореза слайды промывали дистиллированной водой и окрашивали в течение 1 ч в ФБ, содержащем 2.0 мкг/мл бромистого этидия. Препараты анализировали, используя флуоресцентный микроскоп "ЛЮМАМ И-3" ("ЛОМО", Санкт-Петербург, Россия). Захват изображений проводили цифровым фотоаппаратом "Nikon CoolPix 995" (Япония) с последующей передачей их в компьютер. Обработку микрофотографий выполняли с помощью специализированного программного обеспечения, где реализованы алгоритмы расчета стандартных параметров "комет" [12]. На каждую экспериментальную точку брали 3—4 мыши, 2—3 слайда на животное и фотографировали по 50 "комет" на слайде [13].

Уровень повреждений ДНК в лейкоцитах оценивали по количеству ДНК в хвосте "кометы" в процентах — %TDNA [14]. Также оценивалась доля клеток с неповрежденной ДНК (% клеток, не имеющих хвоста "кометы"), и с высокофрагмен-тированной ДНК (% клеток, имеющих более 50% ДНК в хвосте). Клеточность крови мышей контролировали путем вычисления среднего количества нуклеоидов лейкоцитов на микрофотографиях. Средние значения представлены как M ± SD.

Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента (p < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рисунке представлены изображения нук-леоидов лейкоцитов периферической крови не-обл

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком