ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 2, с. 160-168
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 57.086.835:575.164
ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
© 2009 г. А. И. Шевченко, С. П. Медведев, Н. А. Мазурок, С. М. Закиян
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
e-mail: zakian@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 08.10.2008 г.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) получены в результате репрограм-мирования соматических клеток с помощью трансдукции вирусных векторов, экспрессирующих гены Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog и Lin28, которые необходимы для установления и поддержания плюрипотентного состояния. По всем своим свойствам ИПСК практически полностью сходны с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). В настоящее время ИПСК получены из различных типов дифференцированных клеток мыши и человека. Наряду с ЭСК, ИПСК имеют большие перспективы для применения в научных исследованиях и медицине.
Получение линий плюрипотентных клеток млекопитающих является одной из актуальных проблем современной биологии. Плюрипотентные клетки способны дифференцироваться в производные трех зародышевых листков и участвовать в закладке всех тканей и органов организма, включая функциональные гаметы. В норме у млекопитающих плюрипотентностью обладают клетки внутренней клеточной массы бластоцист, которые затем дифференцируются, формируя экто-, энто- и мезодермальные производные эмбриона. В настоящее время хорошо освоено получение линий, активно пролиферирующих и сохраняющих плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) из бластоцист in vitro (см. обзор [1]). Линии плюрипотентных клеток широко используются для исследования и моделирования многих биологических процессов, происходящих на ранних этапах эмбрионального развития. Существует многообещающая возможность использовать плюрипотентные клетки для получения специфических типов клеток и тканей в заместительной клеточной терапии при лечении различных заболеваний человека.
В настоящее время разработан и активно совершенствуется новый подход, позволяющий возвращать в плюрипотентное состояние дифференцированные соматические клетки посредством трансдукции в них вирусных векторов, экспрессирующих определенный набор генов. Полученные при этом плюрипотентные клетки имеют большое сходство с ЭСК и могут использоваться для научных исследований и в медицине.
РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
К ПЛЮРИПОТЕНТНОМУ СОСТОЯНИЮ С ПОМОЩЬЮ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ФАКТОРОВ
Ранее было показано, что геном соматических клеток взрослого организма может быть репро-
граммирован к тоти- и плюрипотентому состоянию (таблица) [2-12]. Успешное репрограммиро-вание дифференцированного генома наблюдалось при трансплантации соматических ядер в энуклеированный ооцит [2] и при слиянии дифференцированных клеток и ЭСК [3-5]. Эти эксперименты показали, что в цитоплазме ооцита и ЭСК имеются определенные факторы, достаточные для репрограммирования к тотипотентному и плюрипотентному состоянию, по крайней мере, отдельных типов дифференцированных клеток. Основываясь на этих данных, исследователи приступили к поиску генов, обусловливающих репро-граммирование. Было выявлено 24 гена, имеющих повышенную экспрессию в плюрипотентных ЭСК мыши [13]. Эти гены в различных комбинациях тестировались на способность индуцировать плюрипотентность. Для этого кодирующая область каждого гена помещалась в ретровирус под управление конститутивного промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии в клетках. Вирусами, несущими разные гены, инфицировали культуру фибробластов мыши. В фиброб-ластах кодирующая часть гена Fbx15, экспрессирующегося в ЭСК, была заменена последовательностью гена устойчивости к неоми-цину. Через некоторое время после проникновения в фибробласты вирусов, экспрессирующих гены Oct4, Sox2, c-Myc, '4, в культуре клеток были выявлены резистентные к неомицину колонии, которые по морфологии напоминали плюри-потентные ЭСК. Полученные клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК). Первые линии ИПСК имели значительные отличия в профиле экспрессии генов по сравнению с ЭСК и при их инъекции в бластоцисты развивались нежизнеспособные химеры.
Подходы к репрограммированию дифференцированных клеток к плюрипотентному состоянию
Описание метода, ссылки Результаты репрограммирования Недостатки
Перенос ядра соматической клетки в энуклеированный ооцит или яйцеклетку (см. обзор [2]) Происходит репрограммирование ядра соматической клетки в ооците, в результате развивается целый организм Низкая эффективность. Нарушение развития у клонированных животных. Этические и правовые ограничения
Слияние ЭСК и дифференцированных клеток [3-5] Гибриды дифференцированных клеток и ЭСК демонстрируют все свойства плюрипотентных клеток Клеточные гибриды не имеют нормального диплоидного набора хромосом
Пермобилизация дифференцированных клеток и обработка белковым экстрактом из плюрипотентных клеток [6-11] Обработанные клетки экспрессируют ряд генов, характерных плюрипотент-ным клеткам, и могут дифференцироваться в разные типы клеток Репрограммированные клетки демонстрируют только отдельные свойства плюрипотентных клеток
Спонтанное репрограммирование к плюрипотентному состоянию региональных стволовых клеток (например, клеток костного мозга) при их культивировании в условиях для поддержания ЭСК [12] Прошедшие репрограммирование клетки плюрипотентны, однако по своим свойствам (морфология, паттерн экспрессии генов) сильно отличаются от ЭСК Низкая эффективность
Репрограммирование дифференцированных клеток с помощью внедрения в них вирусных векторов, экспрессирующих гены Осг4, Бох2, К1/4, с-Мус [13-32] Соматические клетки возвращаются в плюрипотентное состояние и по своим свойствам становятся сходны с ЭСК Инсерционный мутагенез при интеграции вирусов. Реактивация трансгенов, в частности, онкогена с-Мус
В дальнейшем эксперимент был модифицирован: ген устойчивости к антибиотику помещали под контроль промотора генов Nanog [14-16] или О&4 [16], которые более тесно связаны с установлением и поддержанием плюрипотентного состояния, чем ¥Ъх15. Полученные в результате этих экспериментов устойчивые к антибиотику ИПСК демонстрировали все свойства, характерные ЭСК. Они имели морфологию ЭСК, обнаруживали активность теломеразы, экспрессировали гены, характерные для ЭСК, при инъекции в бла-стоцисты давали жизнеспособные химеры, дифференцировались в производные всех трех зародышевых листков и давали фукциональные гаметы.
Из-за низкой частоты образования колоний ИПСК (0.05-0.1%) исследователи допускали, что на самом деле репрограммированию могут подвергаться не собственно дифференцированные соматические клетки, а мезенхимные стволовые клетки, которые в небольшом числе присутствуют в культуре [13, 15]. Наиболее убедительным доказательством того, что ИПСК получаются непосредственно из терминально дифференцированных клеток, могут служить эксперименты по репрограммированию зрелых В-лимфоцитов. Зрелые В-лимфоциты - терминально дифференцированные клетки иммунной системы. В процессе их созревания происходит необратимая перестройка участков ДНК в локусе иммуноглобулинов. Так как эта перестройка обнаруживается в ИПСК, полученных из зрелых В-лимфоцитов, можно быть уверенным, что репрограммирова-
нию к плюрипотентному состоянию подверглись именно терминально дифференцированные клетки [17].
Таким образом, доказано, что, несмотря на множество типов дифференцированных клеток и механизмов, приводящих к их специализации, ре-программирование к плюрипотентному состоянию возможно с помощью сверхэкспрессии всего лишь четырех генов: О&4, Бох2, с-Мус, К1/4.
В дальнейшем при репрограммировании соматических клеток исследователи отказались от использования генов устойчивости к антибиотикам и стали отбирать колонии ИПСК, основываясь исключительно на морфологических критериях [17-32]. Такой подход имеет большие преимущества, так как не требует предварительной генетической модификации соматических клеток. Было отмечено, что в отсутствие селекции не только не произошло изменения плюрипотентных свойств ИПСК по сравнению с ЭСК, но и повысилась частота репрограммирования.
В настоящее время ИПСК мыши получены из фибробластов, гепатоцитов, эпителиальных клеток желудка, нейральных своловых клеток, бета-клеток поджелудочной железы и зрелых В-лим-фоцитов, а ИПСК человека - из фибробластов, синовиацитов и нейральных стволовых клеток [14-32].
Продемонстрировано, что получение ИПСК возможно при использовании различных комбинаций репрограммирующих факторов [20, 27]. В одном из исследований ИПСК из фибробластов человека были получены с использованием ком-
бинации генов, в которую входили: OCT4, SOX2, NANOG и LIN28 [20]. Некоторые гены, относящиеся к семействам Sox (Soxl, Sox3, Sox15 и Sox18), Myc (l-Myc, n-Myc) и Klf (Klfl, Klf2, Klf5), также способны вызывать репрограммирование соматических клеток мыши к плюрипотентному состоянию, но с меньшей эффективностью, чем Sox2, c-Myc, Klf4 [27].
Для получения ИПСК в качестве векторов использовали ретро- и лентивирусы [14-32]. Ленти-вирусы эффективнее проникают в соматические клетки, соответственно при их использовании увеличивается частота образования ИПСК. Однако ретровирусы более рано замолкают и реже реактивируются в ИПСК и их производных.
Отмечено, что использование вирусов для ре-программирования клеток имеет негативные последствия [13, 16, 20, 27], так как они встраиваются в случайные участки генома и приводят к мутациям в кодирующих и регуляторных участках генов. Кроме того, в ИПСК и их производных может наблюдаться реактивация генов, привнесенных при репрограммировании в составе вирусных векторов. Особенно тяжелые последствия в виде индукции апоптоза и малигнизации клеток происходят при реактивации гена c-Myc.
СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ ИПСК И ЭСК
ИПСК сходны с ЭСК. Сходство проявляется в морфологии, паттерне экспрессии генов и эпигенетическом статусе генома [14-32]. Кроме того, как и ЭСК, ИПСК дифференцируются с образованием производных всех трех зародышевых листков при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.