БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 2, с. 258 - 269
УДК 576.385.5
ИНГИБИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНГИОГЕНЕЗА АМЕНТОФЛАВОНОМ
© 2008 г. К. Гурувайораппан, Дж. Куттан*
Department of Immunology, Amala Cancer Research Centre, Amala Nagar, Thrissur, Kerala State 680 555, India; fax: ++91 4872307020, E mail: amalaresearch@rediffmail.com
Поступила в редакцию 20.02.07 После доработки 11.07.07
Образование новых капилляров из уже существующих сосудов является критическим для роста и метаста-зирования опухоли. Показано, что аментофлавон — бифлавоноид, полученный из Biophytum sensitivum, ин-гибирует процесс ангиогенеза. Аментофлавон в нетоксических концентрациях (0,05—0,2 мкг/мл) оказывал значительное ингибирующее действие на такие ключевые события процесса ангиогенеза, как пролиферация и миграция клеток эндотелия, а также на способность этих клеток к формированию трубочек. Исследования in vivo на мышах линии C57BL/6 показали, что аментофлавон существенно (на 52,9%) ингибиро-вал образование капилляров, стимулированное возникновением опухоли. Аментофлавон оказывал ингибирующее действие на продукцию таких контролирующих процесс ангиогенеза эндогенных факторов, как IL-1ß, IL-6, TNF-a, GM-CSF и VEGF. Аментофлавон усиливал продукцию IL-2 and TIMP-1 веществ, способных сдвигать (ангиогенное) равновесие в сторону ангиостатического состояния. Антиангиогенная активность аментофлавона также подтверждается заметным уменьшением количества новых капилляров, вырастающих из аорты крысы. Продемонстрировано, что аментофлавон может ингибировать продукцию мРНК VEGF в клетках B16F-10. Полученные данные указывают на то, что аментофлавон ингибирует ангиогенез, нарушая взаимосвязь клеток эндотелия и воздействуя на эндогенные факторы, необходимые для процесса неоваскуляризации.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: аментофлавон, ангиогенез, клетки эндотелия, воспалительные цитокины, образование сосудистых трубочек.
Ангиогенез представляет собой процесс роста новых капилляров из ранее существовавших сосудов и является критическим фактором для различных физиологических и патологических процессов, в частности для опухолевого роста и метастазирования. Ангиогенез — процесс, подчиняющийся жесткой регуляции и играющий существенную роль в эмбриогенезе. Во взрослом организме ангиогенез происходит только при таких процессах, как овуляция, циклическая пролиферация эндометрия и заживление ран [1]. Известен целый ряд как проангиоген-ных, так и антиангиогенных молекул, модули-
Принятые сокращения: ELISA — ферментный им-муносорбентный анализ, IL — интерлейкин, bFGF — основной фактор роста фибробластов, HUVEC — клетки эндотелия пупочной вены человека, TNF — фактор некроза опухоли, GM-CSF — грануло-моноцитарный колониести-мулирующий фактор, MMP — металлопротеазы матрикса, TIMP — ингибитор металлопротеаз в тканях, VEGF — фактор роста эндотелия сосудов, iNOS — индуцибельная нит-рооксидсинтетаза.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
рующих неоваскуляризацию, вызванную образованием опухоли и ее прогрессией [2—5]. Эти молекулы могут воздействовать на различные сигнальные пути и стимулировать миграцию и пролиферацию различных типов клеток, формирующих функциональные кровеносные сосуды [6]. Ожидается, что лекарственные препараты, блокирующие молекулярные события, которые способствуют неоангиогенезу опухоли, могут быть эффективны при лечении широкого спектра опухолей. Соответственно предполагается, что лечение ингибиторами ангиогенеза будет переноситься лучше, чем общепринятая ци-тотоксичная опухолевая терапия, воздействующая на все быстро растущие клетки.
Флавоноиды представляют собой широко распространенные полифенольные соединения, выделяемые из растений и обладающие разнообразными биологическими функциями. Амен-тофлавон — бифлавоноид, обнаруженный у ВюркуШт яетШуит (рис. 1), обладает противовирусной [7, 8], противовоспалительной [9], ан-тидепрессантной [10], антиоксидантной [11] и
ОН ¡✓Y
XX) т т НО О ОН
ОН О ОН N О
Рис. 1. Химическая структура аментофлавона
анальгезирующей [12] активностями. Аментоф-лавон — ингибитор фосфолипазы Сг1 [13], он также необратимо ингибирует пролиферацию лимфоцитов [14], а также является ингибитором синтетазы оксида азота в макрофагах [15]. Он проявляет значительную ингибирующую активность в отношении cAMP-фосфодиэстеразы в жировых тканях крысы [16], подавляет неферментативное переокисление липидов [17] и ингибирует катепсин В, один из членов папаино-вого суперсемейства цистеиновых протеаз [18]. Аментофлавон является эффективной ловушкой супероксида [19]. Продемонстрировано его ингибирующее воздействие на деградацию 1кВб и транслокацию NF-кВ в ядро [20].
В настоящем исследовании было показано, что аментофлавон проявляет выраженное инги-бирующее действие на ангиогенез в условиях in vitro и in vivo. Аментофлавон оказывал подавляющее действие на такие ключевые события ангио-генеза, как пролиферация и миграция клеток эндотелия, а также способность этих клеток к образованию трубочек. Опыты in vivo с перевивкой клеток меланомы B16F-10 мышам линии C57BL/6 показали, что аментофлавон в значительной степени подавляет ангиогенез опухоли, что подтверждает данные, полученные в экспериментах in vitro. Подавление ангиогенной активности в условиях in vivo коррелировало с изменением уровня цитокинов, пониженным содержанием мРНК VEGF и уменьшением количества сформированных опухолью капилляров. Наши данные указывают на антиангиогенную активность аментофлавона и могут способствовать дальнейшему повышению эффективности этого соединения при его использовании для подавления опухолевого роста и метастазирования.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы и химикаты. Аментофлавон выделяли из ВюркуШт зетИ^ит, как было описано ранее [21], и сравнивали с аутентичным образцом методами тонкослойной хроматографии,
измерения поглощения в ультрафиолетовой области, 13С-ЯМР и масс-спектроскопии. Аментофлавон и (или) TNP-470 (полученный от доктора Равиварма, США), растворяли в DMSO (0,1%) или суспендировали в гуммиарабике (1%) при использовании соответственно в опытах in vitro и in vivo.
Для определения содержания IL-1ß, IL-6, TNF-a, GM-CSF и IL-2 мыши методом ELISA использовались наборы реагентов фирмы Pierce Endogen («Rockford», США). Для определения VEGF и TIMP-1 методом ELISA использованы наборы реактивов фирмы «R & D system» (США). Для проведения теста MTT использовали 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид) фирмы «Sigma Chemical Co.» (США). Все использованные реактивы были степени очистки «х.ч.» или более высокой.
Клеточные линии и тканевые культуры. Клетки HUVEC были получены из пуповинной вены человека с помощью обработки коллагеназой, как описано ранее [22]. Клетки HUVEC культивировали в покрытых желатином флаконах площадью 75 см2 в среде М199 («HiMedia», Индия) с добавлением 20% (V/V) эмбриональной сыворотки теленка («Biological Industries», Израиль), 100 ед/мл пенициллина, 100мкг/мл стрептомицина, 500 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF; «Pepro Tech, Inc.», США) и 100 нг/мл фактора роста эндотелия сосудов (VEGF; «Pepro Tech, Inc.»). Клетки B16-F10 ме-ланомы мыши (National Centre for Cell Sciences, Индия) культивировались как монослойная культура в среде DMEM («HiMedia») с добавлением 10% (V/V) FCS и антибиотиков. Все линии клеток культивировали при температуре 37° во влажной среде, содержащей 5% CO2.
Животные. Мыши-самцы линии C57BL/6 (в возрасте 5—6 недель, весом 20—25 г) получили из National Institute of Nutrition (Индия). Все мыши содержались и использовались в строгом соответствии с правилами и предписаниями Комитета по этике экспериментальных животных Правительства Индии.
Определение жизнеспособности клеток в тесте МТТ. Клетки эндотелия (106 клеток/мл) инкубировали с аментофлавоном в интервале концентраций 0,5—10 мкг/мл в течение 6 сут в 96-луночных плашках. Жизнеспособность клеток подсчитывали с помощью измерения поглощения при длине волны 570 нм после инкубации с МТТ в течение 4 ч при 37° [23, 24].
Тест на активность ангиогенеза in vitro. Аорту крысы культивировали, как описано ранее, с небольшими модификациями [25]. Самцов крыс линии Sprague-Dawley весом 230 г умерщвляли декапитацией; грудную аорту крыс сразу же из-
влекали и помещали в раствор PBS, содержавший 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Аорту очищали в стерильных условиях, трижды промывали раствором PBS и нарезали на кольца шириной 1 мм. Кольца аорты культивировали в течение 6 сут в покрытых коллагеном лунках с кондиционированной средой (100 мкл), полученной от клеток B16F-10 и возрастающими концентрациями аментофлаво-на (0,05—0,2 мкг/мл). Количество выросших из колец аорты капилляров подсчитывали под фа-зово-контрастным микроскопом, после чего вычисляли процент ингибирования роста капилляров по следующей формуле:
(С - T)/C • 100,
где С и T — количество выросших капилляров соответственно в контрольной и опытной группе.
Исследование пролиферации клеток эндотелия. Клетки эндотелия (5 • 104 клеток) культивировали в течение 24 ч в присутствии возрастающих концентраций аментофлавона (0,05—0,2 мкг/мл) и VEGF (2 нг/мл); пролиферативную активность оценивали по включению в клетки [3H]-тимидина [26]. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack Beta («Pharmacia», Швеция).
Исследование миграции клеток в рану in vitro. Исследование миграции клеток в рану in vitro проводилось, как описано ранее [27]. Единичная рана создавалась с помощью стерильного пластикового наконечника в центре монослоя клеток эндотелия. После создания раны клетки культивировали в течение 48 ч в присутствии возрастающих концентраций аментофлавона (0,05—0,2 мкг/мл) и VEGF (2 нг/мл). Затем клетки окрашивали в течение 10 мин 0,1% (m/V) раствором кристалл виолета. Клетки, мигрировавшие в рану, подсчитывали и фотографировали под фазово-контрастным микроскопом (40-кратное увеличение).
Исследование образования трубочек. Исследование образования трубочек клетками эндотелия проводили, как описано ранее [28]. Клетки эндотелия (5 • 104 клеток) культивировали в теч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.