научная статья по теме ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ТРИБЛОК-СОПОЛИМЕРОВ ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДА И ПОЛИПРОПИЛЕНОКСИДА НА АГРЕГАЦИЮ И СЛИЯНИЕ АТЕРОГЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ Химия

Текст научной статьи на тему «ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ТРИБЛОК-СОПОЛИМЕРОВ ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДА И ПОЛИПРОПИЛЕНОКСИДА НА АГРЕГАЦИЮ И СЛИЯНИЕ АТЕРОГЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1272 - 1281

УДК 612.1+616.1+544.7

ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ТРИБЛОК-СОПОЛИМЕРОВ ПОЛИЭТИЛЕНОКСИДА И ПОЛИПРОПИЛЕНОКСИДА НА АГРЕГАЦИЮ И СЛИЯНИЕ АТЕРОГЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ

© 2015 И.Г. Панова1*, В.В. Спиридонов1, И.Б. Каплан2, С.С. Трубинов3, Н.В. Елизова3, А.А. Мельниченко3, А.Н. Орехов3, А.А. Ярославов1

1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)932-8846,

электронная почта: igpan@mail.ru

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-2776

3 Институт общей патологии и патофизиологии РАМН, 125315Москва; факс: +7(495)601-2366

Поступила в редакцию 27.11.14 После доработки 12.01.15

Показано, что триблок-сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленоксида (плюроники) влияют на агрегацию и слияние атерогенных липопротеидов низкой плотности (атЛНП) и способны ингибировать эти процессы. Характер воздействия и степень стабилизирующего эффекта зависят от строения, относительной гидрофобности сополимера и его концентрации. Наибольшей способностью подавлять агрегацию атЛНП обладают плюроники Ь61, Р85 и Ь64, характеризирующиеся значением гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) 3—16. Плюроник Ь81 с более высокой степенью гидрофобности (ГЛБ = 2) при низких концентрациях лишь частично ингибирует агрегацию атЛНП; при высоких стимулирует этот процесс. Продемонстрировано, что действие плюроников напрямую не связано с их способностью к мицеллообразованию, активным началом сополимера служат единичные макромолекулы. Высказано предположение, что вызываемые плюрониками эффекты обусловлены их взаимодействием с липидной составляющей ЛНП, а также возможным влиянием этих сополимеров на структурные и гидрофильно-липофильные характеристики липопро-теидов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: липопротеиды низкой плотности, плюроники, триблок-сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленоксида, атеросклероз; подавление агрегации, антиатерогенные свойства.

Плюроники (блок-сополимеры окиси этилена и окиси пропилена) являются водорастворимыми неионогенными поверхностно-активными соединениями, гидрофильной частью которых является блок полиэтиленоксида (ПЭО), а гидрофобной — блок полипропиленоксида (ППО). Совокупность таких разнообразных свойств как дифильность (и связанная с этим мембрано-тропность плюроников), выраженная химическая инертность полимерной цепи, низкая токсичность создают предпосылки для широкого применения этих полимеров в биологии и медицине. Плюроники используются в качестве ми-целлярных контейнеров для доставки лекарств [1, 2], выполняют роль стабилизаторов перфтор-

* Адресат для корреспонденции.

углеродных эмульсий в препаратах искусственных заменителей крови [3], они включены в состав композиций для лечения ран и ожогов [4, 5], применяются для низкотемпературного консервирования тканей [6], в иммунотерапии — в качестве адъювантов [7], устраняют проявление синдрома множественной лекарственной устойчивости [8—10].

Нами было обнаружено, что отдельные плю-роники способны подавлять накопление липи-дов в клетках интимы сосудов, что является ранним и наиболее заметным проявлением атеросклероза [11]. Основным источником накапливающихся липидов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП), полимолекулярные ансамбли, в состав которых помимо липидов входит белок аполипопротеин В100 (апоВ) [12].

Количество внутриклеточных липидов возрастает с увеличением среднего размера частиц ЛНП, циркулирующих в плазме [13—15]. Отметим, что в крови человека с ишемической болезнью сердца наряду с нативными ЛНП присутствуют множественно модифицированные ли-попротеиды (ммЛНП), значительно отличающиеся от нативных по ряду физико-химических показателей [16, 17]. Количество in vivo модифицированных липопротеидов составляет 5—20% от общего содержания ЛНП [18]. Именно ммЛПН способствуют развитию агрегации и вызывают увеличение содержания липидов в клетках, то есть являются атерогенными [17, 19]. Показано [20], что отрицательно заряженные ЛНП, составляющие одну из субфракций ммЛНП, способны стимулировать агрегацию даже нативных липопротеидов, не являющихся атерогенными.

Ранее установлено [11], что плюроники Р85 и L61 с высоким содержанием гидрофобных пропиленоксидных (ПО) звеньев подавляют агрегацию липопротеидов (обладают антиатеро-генным действием), а плюроник F68 с повышенным содержанием гидрофильных этиленок-сидных (ЭО) звеньев практически не влияет на агрегацию липопротеидных частиц. Высказано предположение [11], что эффективность инги-бирующего действия плюроников определяется их способностью формировать мицеллярные структуры в водно-солевых растворах и поэтому должна коррелировать с их критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). В настоящей работе проанализировано влияние строения и физико-химических характеристик плю-роников (гидрофильно-липофильного баланса и ККМ) на подавление агрегации атерогенных липопротеидов, полученных из крови больных с атеросклерозом.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовали ЛНП, полученные от здоровых доноров (мужчин и женщин 27—45 лет), и пули-рованные липопротеиды, полученные из сывороток крови от 42 больных с ангиографически документированным атеросклерозом. Уровень общего холестерина в обеих группах не превышал 240 мг/дл. ЛНП от здоровых лиц характеризовались тем, что не вызывали накопления внутриклеточных липидов при инкубации в культуре моноцитов-макрофагов человека, т.е. были неа-терогенными. В то время как пулированные ли-попротеиды от больных с подтвержденным атеросклерозом вызывали статистически значимое увеличение липидов в культивируемых клетках, т.е. являлись атерогенными.

Гидродинамические характеристики исследуемых образцов определяли методом динамического светорассеяния с помощью фотометра рассеянного лазерного света «АЬУ-5» фирмы «А!У» (Германия) и фотонного корреляционного спектрометра фирмы «РИоШсогИш^теПз» (Россия). Оба прибора снабжены Не-№-лазером мощностью 25 мВт с длиной волны X = 632,8 нм. Растворы обеспыливали двухкратным фильтрованием через мембранные фильтры «МЦЦроге» (США) со средним размером пор 1,2 мкм. Рассеянный свет регистрировали под углом 9 = 90°. Математическую обработку экспериментально регистрируемых автокорелляционных функций рассеянного света проводили с использованием пакета программ DynaLs («А1а^о», Израиль). Получали функции распределения W по временам релаксации т = 1/Dq2, где Б — коэффициент поступательной диффузии частиц, q = (4пп/Х) х х 8т(9/2) — волновой вектор рассеянной волны, п — показатель преломления растворителя. Гидродинамический диаметр частиц 2 х рассчитывали по формуле Стокса:

Rh —

kT

6nnoD

(1)

Использовали коммерческие препараты плю-роников: L61 («Serva», Германия), L64, P85, L81 («CarboMer», США).

Общую фракцию липопротеидов выделяли из сыворотки двухстадийным ультрацентрифугированием в градиенте плотности NaBr на центрифуге L8-55 (ротор 65Ti, «Beckman Instruments, Inc.», США) [21]. Концентрацию белка в ЛНП определяли по методу Лоури. Непосредственно перед каждым проводимым исследованием суспензию ЛНП освобождали от пыли и спонтанно образующихся агрегатов путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм («Nal-gene», США).

где Rh - значение гидродинамического радиуса; вязкость воды по при температуре 25° принимали равной 0,89 сП.

Агрегацию липопротеидов инициировали путем непрерывного перемешивания (400 об/мин) суспензии ЛНП в концентрации 0,5—1,5 г белка/л в инкубационном растворе — изотоническом фосфатном буфере (ИФБ; «GIBCO», «Paisley», Великобритания; KCl — 0,2 г/л, KH2PO4 — 0,2 г/л, NaCl - 8 г/л, Na2HPO4 - 1,15 г/л, рН 7,2) при 37°. Кинетику агрегации регистрировали методом статистического анализа флуктуаций све-топропускания луча света длинной волны 860 нм с помощью лазерного анализатора ассоциации

тромбоцитов Aggregation Analyser — Biola Ltd. («Юнимед», Россия) [22, 23]. Метод основан на том, что относительная дисперсия колебаний оптической плотности, вызванных случайными изменениями в количестве частиц, попадающих в оптический путь лазерного луча, отражает отклонения от их среднего размера, то есть степень их ассоциации и агрегации [20, 21]. Степень агрегации ЛНП и их устойчивость к агрегации оценивали по динамике изменения средних размеров образующихся частиц.

Для проведения электронно-микроскопического исследования суспензии липопротеи-дов при концентрации белка 0,2 г/л наносили на сеточки с формваровой пленкой-подложкой и контрастировали 2%-ным водным раствором уранилацетата. Образцы анализировали с помощью микроскопа JEOL-1400 («JEOL», Япония) при увеличениях от 20 000 до 100 000 раз. Цифровые изображения получали с использованием камеры OSIS и программного обеспечения OSIS iTEM.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве модуляторов процессов агрегации липопротеидов нами были использованы три-блок-сополимеры ПЭО и ППО (плюроники) с различной степенью полимеризации гидрофильного (ПЭО) и гидрофобного (ППО) блоков и различным значением гидрофильно-гидрофобного баланса (ГЛБ), отражающим относительное содержание каждого из блоков. Меньшее значение ГЛБ соответствовало меньшему относительному содержанию гидрофильных

блоков (или большему содержанию гидрофобных блоков). Характеристики использованных плюроников приведены в табл. 1. Амфифиль-ные молекулы плюроников в водных растворах ассоциируют, образуя мицеллы с гидрофобным ППО ядром и гидрофильной ПЭО короной, включающие от нескольких десятков до сотни молекул полимера [24—26]. Формирование мицелл начинается выше некоторой концентрации полимера, критической концентрации мицел-лообразования.

Для исследования способности плюроников к самоассоциации в инкубационном растворе, содержавшем неорганические соли, мы использовали метод динамического светорассеяния. Измерения проводили при 37°. В табл. 1 показано изменение среднего диаметра частиц плюро-ников в растворе в зависимости от концентрации полимеров. Как видно из таблицы, частицы в растворах плюроников регистрировались при концентрациях, превышавших некоторое пороговое зна

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком