БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 8, с. 985 - 998
УДК 577.152.31
ИНГИБИРУЮЩЕЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ Ds-Na В ПОСТМИЦЕЛЛЯРНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ НА ТЕРМИЧЕСКУЮ АГРЕГАЦИЮ И АКТИВНОСТЬ ПАПАИНА*'**
© 2014 Атиятул Квадир, Масиуз Заман, Ризван Х. Хан***
Interdisciplinary Biotechnology Unit, Aligarh Muslim University, Aligarh-202002, India; fax: (91)571-2721776, E-mail: rizwanhkhan@hotmail.com, rizwanhkhan1@gmail.com
Поступила в редакцию 21.02.14
Цистеиновая протеаза (папаин из млечного сока Carica papaya) подвержена необратимой термической денатурации. Установлено, что развертывание (анфолдинг) папаина при повышенной температуре происходит одновременно с процессом его самоагрегации, протекающем при температуре свыше 50°. Степень агрегации белка увеличивалась при повышении его концентрации от 3 до 40 мкМ. Агрегация папаина изучена турбодиметрическим методом, подтверждена наблюдением за интенсивностью светорассеивания и интенсивностью флуоресценции 1-анилино-8-нафталинсульфонат (АНС), а также методом трансмиссионной электронной микроскопии. Термическая агрегация папаина значительно снижалась в присутствии доде-цилсульфата натрия (Ds-Na) в постмицеллярной концентрации. Методом кругового дихроизма (КД) в области «дальнего» УФ установлено, что Ds-Na способствовал значительному увеличению количества а-спи-ральных структур в молекуле папаина, предотвращал анфолдинг белка и, тем самым, ингибировал процесс его агрегации. Максимальную активность папаин проявлял при нейтральном рН и при 65°, однако в присутствии 6 мМ Ds-Na (выше критической концентрации мицеллообразования, ККМ) активность фермента снижалась в «10 раз. Таким образом, использование Ds-Na для повышения степени спирализации белка не решало всех проблем, связанных с агрегацией таких важных для промышленности белков как папаин, поскольку требовалось не только предотвратить его агрегацию, но и сохранить в функционально активном состоянии в присутствии ингибиторов агрегации.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: папаин, термическая агрегация, додецилсульфат натрия (Ds-Na), круговой дихроизм (КД), критическая концентрация мицеллообразования (ККМ), 1-анилино-8-нафталинсульфонат (АНС).
Агрегация белков в процессе их очистки, переработки и хранения является одним из препятствий к широкомасштабному производству препаратов на основе протеиновых соединений [1]. Кроме того, помимо термической инактивации [2] агрегация оказывает негативное влияние на производство важных для промышленности функционально активных белковых продуктов. Известно, что на агрегацию белков оказывают влияние такие внешние факторы как температура, концентрация белка, рН среды, присутствие дополнительных растворителей и прочие [3]. Среди них наибольшее влияние имеет темпера-
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-048, 15.06.2014.
*** Адресат для корреспонденции.
тура [4—7], поскольку частичная денатурация (анфолдинг) белка при температуре выше критической приводит к экспонированию гидрофобных аминокислотных остатков и немедленной агрегации белка [8]. Недавние исследования позволили заключить, что первый этап агрегации белка связан с частичным нарушением его природной конформации. При этом некоторые особые районы белковых молекул (гидрофобные участки, свободные 8И группы) становятся более доступными для межмолекулярных взаимодействий, что приводит к образованию агрегатов [9, 10]. В настоящее время не существует единого решения проблемы агрегации белка, однако признается, что внутримолекулярные взаимодействия способствуют сворачиванию полипептидной цепи в ее нативную кон-формацию, тогда как усиление межмолекулярных взаимодействий приводит к появлению
5
985
белковых агрегатов. Поэтому, использование соединений, препятствующих образованию связей между белковыми молекулами, может предотвращать соответствующие неблагоприятные последствия и способствовать поддержанию белка в нативном состоянии [11]. Это относится и к решению проблемы с агрегацией белков путем добавления в раствор таких соединений как сахара, аминокислоты, амины, соли, высокомолекулярные спирты, а также некоторые полимеры и поверхностно-активные вещества [12].
Известно, что ионные детергенты, в частности, додецилсульфат натрия (Ds-Na), оказывают существенное влияние на способность белка к агрегации в зависимости от его концентрации. Причем, в низкой (субмицеллярной концентрации) Ds-Na индуцирует агрегацию, тогда как в высокой концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразова-ния (постмицеллярная концентрация), этот детергент существенно тормозит слипание белковых молекул между собой [13—15]. Предполагается, что ингибирование агрегации Ds-Na в постмицеллярной концентрации обусловлено формированием в полипептидной цепи дополнительных спиральных структур. Это приводит к увеличению доли высокоспирализованных белковых молекул со стабилизированными внутримолекулярными взаимодействиями, не склонных к образованию межмолекулярных связей [13, 16]. Такая линия поведения приписывалась главным образом белкам, подверженным образованию амилоидных фибриллярных структур и связанных с нейродегенеративными заболеваниями [14, 16, 17]. Однако было не ясно, могло ли это относиться к важным для промышленности белкам, когда необходимо не только предотвратить их агрегацию, но и требуется сохранить белок в функционально-активном состоянии в присутствии ингибиторов агрегации.
Папаин — это цистеиновая протеаза, полученная из млечного сока папайи (Carica papaya). Фермент относится к классу белков а + в, состоящих из двух различных доменов, сворачивающихся независимо друг от друга [18]. Этот белок хорошо изучен, поскольку очень широко используется в различных областях индустрии: при производстве напитков и выпечки, выделке кож, обработке шелка в текстильной промышленности, перераработке хитозана, при производстве косметики и обработке фотографической пленки, синтезе детергентов и т.д. [19].
Изучение термической денатурации папаина с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии показало, что фермент денатурирует необратимо [20]. Оставалось неяс-
ным, агрегировал ли белок во время термической денатурации. В представленной работе с использованием спектроскопии и микроскопического анализа мы продемонстрировали, что разворачивание папаина при повышении температуры при нейтральных рН сопровождалось его агрегацией, степень которой повышалась при увеличении концентрации белка. В дальнейшем мы установили, что после предварительной инкубации папаина с Ds-Na в постми-целлярной концентрации значительно снижалась степень его агрегации при повышении температуры. Кроме того, обнаружено, что в присутствии Ds-Na значительно увеличивалась степень спирализации белка, однако не сохранялась его ферментативная активность. Таким образом, стимуляция спирализации белка для ин-гибирования его агрегации не может являться подходящей стратегией для предотвращения термической самоагрегации важных для промышленности белков/ферментов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Папаин из Carica papaya (P4762), додецилсульфат натрия (Ds-Na), L-цистеин и АНС (1-ани-лино-8-нафталинсульфонат) — «Sigma- Aldrich» (США). Все остальные реагенты были аналитической чистоты.
Приготовление образцов. Папаин растворяли в 20 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 5 мМ тетратионата для ингибирования протеолитической активности; раствор белка диализовали. Концентрацию белка (e2f0 nm = 25) определяли на спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer») [21]. Мол. массу папаина принимали за 23 40б Да [22]. Ds-Na растворяли в 20 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,0. Все растворы фильтровали через мембранные фильтры (диаметром пор 0,45 мкм) с помощью шприца.
Определение pH выполняли на рН-метре Seven Easy S20-K («Mettler Toledo») с использованием электрода типа Expert «Pro3 in 1» с точностью до 0,01.
Круговой дихроизм. Определение спектров КД проводили на спектрополяриметре J-815 («JASCO») в кюветах с длиной оптического пути 1 мМ. Прибор калибровали с помощью D-10-кам-форсульфоновой кислоты. Термическую денатурацию папаина определяли путем измерения КД при 222 нм в диапазоне температур от 20 до 90° при скорости повышения температуры 1°/мин. Спектры КД белка в области «дальнего» УФ (190—250 нм) регистрировали в диапазоне температур от 20 до 90° через каждые 5°. Значения MRE (средняя остаточная эллиптичность, гра-
дус х см2 х дмоль-1) рассчитывали по следующему уравнению: MRE = (9obs (m deg)/(10 х n х l х Cp), где 9obs — КД в миллиградусах, n — количество аминокислотных остатков в белке (212), l — оптический путь в см (0,1), Cp — концентрация белка в М.
Обратимость термозависимых изменений в белке определяли при охлаждении образцов в диапазоне температур от 90 до 20° при скорости снижения температуры 1°/мин. Процентное содержание а-спиралей и р-слоев в белке при определенных условиях рассчитывали с помощью онлайн программы K2D3 [23] с использованием значений MRE из спектров КД при 190—240 нм.
Турбидиметрические измерения мутности белковых растворов при определенных условиях в диапазоне температур 20—90° определяли по поглощению при 350 нм на двулучевом спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer»). Зависимость мутности белковых растворов от времени при различной температуре определяли аналогично.
Релеевское светорассеивание белковых растворов определяли на спектрофлуориметре F-4500 («Hitachi») в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Спектры эмиссии флуоресценции в диапазоне длин волн от 300 до 400 нм в определенных условиях регистрировали при длине волны возбуждающего света 350 нм и при ширине щели 5 нм.
Флуоресценция АНС. АНС растворяли в дистиллированной воде и определяли его концентрацию с использованием sM = 5000 M-1 см-1 при 350 нм. Связывание АНС с белком проводили в течение 30 мин в темноте путем инкубации белка с 50х избытком реагента. Спектры эмиссии флуоресценции регистрировали в диапазоне длин волн 400-600 нм при длине волны возбуждающего излучения 380 нм при ширине щели 5 нм.
Определение протеолитической активности. Активность пап
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.