ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 3, с. 265-271
УДК 577.152.3
ИНГИБИТОР ХИМОТРИПСИНА И ТРИПСИНА ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ
© 2011 г. Т. A. Ревина, И. A. Парфёнов, Е. Л. Гвоздева, Н. Г. Герасимова, Т. A. Bалуева
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: valueva@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 31.05.2010 г.
Из клубней картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова) выделен и очищен до гомогенного состояния белок, обозначенный как PKCI-23 (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor). Очистку белка проводили с помощью методов гель-хроматографии на сефадексе G-75 и ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B. Белок PKCI-23 с одинаковой степенью эффективности подавлял активность химотрипсина и трипсина, образуя с ферментами эквимолярные комплексы. Значительно слабее он действовал на субтилизин Карлсберг. Определена N-концевая 20-членная аминокислотная последовательность белка PKCI-23. Показано, что ингибитор PKCI-23 в различной степени угнетает рост и развитие патогенных микроорганизмов Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. и Phytophtora infestans (Mont.) de Bary, поражающих картофель.
Картофель (Solanum tuberosum L.) относится к числу ведущих и наиболее ценных продовольственных культур в большинстве стран мира, занимая одно из важнейших мест среди продуктов питания, так как достаточно дешев и обладает относительно высокой питательной ценностью [1]. В настоящее время в связи с необходимостью повышения качества питания, включающее снижение калорийности пищи и увеличение содержания полноценного белка, вносятся серьезные коррективы и в селекцию картофеля, направленные на создание сортов с пониженным содержанием крахмала [2].
Ранее из клубней картофеля сорта Истринский, характеризующийся высоким содержанием крахмала (до 20%), нами были выделены несколько белков, один из которых (PSPI-21) подавлял активность ряда сериновых протеиназ клана химотрипсина (эластазы из лейкоцитов человека (HLE), трипсина и химотрипсина) [3], другой (PK-SI) — специфически действовал на субтилизин [4], а третий (PKTI-22) — на трипсин [5]. Белки были отнесены к подсемейству картофельных ингибиторов протеиназ типа Кунитца (PKPI, potato Kunitz-type proteinase inhibitors) и локализованы в различных структурных группах, на которые белки PKPI были разделены на основании особенностей их N-концевых аминокислотных последовательностей [6]. Так, белки PSPI-21 и PKTI-22 принадлежали к группе PKPI-B, белок PKSI — к группе PKPI-С. Было показано, что все три белка подавляют рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов, поражающих растение картофеля
[3—5], а некоторые из них накапливаются в инфицированных клубнях [7]. Таким образом, можно с большой степенью вероятности заключить, что изученные белки-ингибиторы играют важную роль в защите растения от атаки патогенными микроорганизмами.
Новый сорт картофеля Юбилей Жукова, в настоящее время районированный и возделываемый в Московской области, является сортом столового назначения. Для него характерно невысокое содержание крахмала (до 14%). Кроме того, растения картофеля этого сорта обладают повышенной устойчивостью к вирусным заболеваниям и поражению фитопатогенными микроорганизмами [2]. В связи с этим определенный интерес представляет изучение белковых ингибиторов, присутствующих в клубнях данного сорта картофеля, и их роли как в повышении его питательной ценности, так и в защитных процессах растения.
Цель работы — выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова белка, действующего как ингибитор химотрипсина, изучение его свойств и определение N-концевой аминокислотной последовательности.
МЕТОДИКА
В работе использовали клубни картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова), которые хранили в течение 2—4 мес в темноте при 4°С, а также трипсин (КФ 3.4.21.4, "Spofa", Чехия), дополнительно перекристаллизованный из сульфата магния, а-химотрипсин (КФ 3.4.21.1, "Serva", Гер-
мания), субтилизин Карлсберг (КФ 3.4.21.14, "Sigma" США), папаин (КФ 3.4.22.1, "Calbiochem", США) и в качестве субстратов — казеин (НПО "Биолар", Латвия) и я-нитроанилиды: N-сукцинил-Ь-глицил-Ь-глицил-Ь-фенилаланина (СукГГФПА), Na-бензоил-Ь-аргинина (БАПА), N-карбобензок-си- Ь-аланил- Ь-аланил- Ь-лейцина (КбзААЛПА) и Ь-пироглутамил-Ь-фенилаланил-Ь-лейцина (ПгФЛПА) ("Calbiochem", США). В работе использовали сефадексы G-75 и G-25, КМ-сефарозу СЬ-6В и низкомолекулярные белки-маркеры фирмы "Pharmacia" (Швеция).
Белки из сока клубней картофеля осаждали (NH4)2SO4. Осадок растворяли в 0.05 М бикарбонате аммония, рН 7.8 и подвергали гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75, как описано ранее [4]. Фракции, содержащие белки с молекулярной массой 20—25 кДа, объединяли и лиофильно высушивали.
Белки с молекулярной массой 20—25 кДа (35 мг) растворяли в 2.5 мл 0.04 М ацетатного буфера, pH 4.3 и наносили на колонку (0.5 х 15 см) с КМ-сефарозой СЬ-6В, уравновешенную тем же буфером. Сорбент промывали стартовым буфером до полного удаления материала, поглощающего при 280 нм. Связавшийся с ионообменником белок элюировали линейным градиентом концентрации NaCI от 0 до 0.5 M в стартовом буфере. Во фракциях элюента определяли активности ингибиторов химотрипсина, трипсина и субтилизина Карлс-берг. Фракции, содержащие материал с максимальной активностью ингибитора химотрипсина, объединяли, обессоливали на колонке с сефадек-сом G-25 и лиофильно высушивали.
Диск-электрофорез в 20%-ном ПААГ в присутствии ДДС-Na и Р-меркаптоэтанола проводили по Лэммли [8]. Гели окрашивали 0.1%-ным раствором кумасси R-250 в 25%-ном растворе этанола, содержавшем 5% формальдегида.
Молекулярные массы ингибитора и его комплексов с ферментами определяли методом высокоэффективной гель-хроматографии (ВЭГХ) на жидкостном хроматографе Стайер ("Аквилон", Россия), используя колонку Bio Sep-Sec-S-200 (300 х 7.8 мм, "Phemomenex", США). Гель уравновешивали 0.02 M КН2РО4-буфером, pH 7.0, содержавшим 0.1 М NaCl. Белок (0.7 мг/мл) растворяли в стартовом буфере, наносили на колонку Bio Sep-Sec-S-200 и элюировали тем же буфером. Для получения комплексов белок (0.7 мг/мл) инкубировали с трипсином или химотрипсином (0.5 мг/мл) в течение 10 мин при комнатной температуре. Для определения тройного комплекса использовали
смесь, содержащую равные количества (0.5 мг/мл) белка, трипсина и химотрипсина.
Концентрацию белка определяли модифицированным методом Брэдфорд [9] с использованием в качестве стандарта БСА.
Секвенирование белков осуществляли на се-квенаторе 470А ("Applied Biosystems", США) по стандартной программе 02 RPTH [10]. Для идентификации фенилтиогидантоиновых производных аминокислот использовали ВЭЖХ в обращенной фазе на колонке с сорбентом С18 ("Applied Biosystems") в 20%-ном ацетонитриле. Детекцию производных аминокислот осуществляли на проточном абсорбциометре 757 ("Cratos", США).
Активность ингибитора оценивали по степени подавления активности соответствующих ферментов. Активность ферментов определяли по скорости гидролиза казеина [11] и хромогенных субстратов: для химотрипсина использовали СукГГФПА, трипсина — БАПА, субтилизина — КбзААЛПА и для папаина — ПгФЛПА [12—15]. Амидолитиче-скую активность сериновых протеиназ измеряли в 0.05 М трис-На-буфере, рН 8.0, при 37°C, используя 1.0 мМ соответствующего хромогенного субстрата (я-нитроанилида пептида) в 1.0 мл конечного объема пробы. Концентрация ферментов в пробе составляла для химотрипсина, трипсина и субтилизина 1.0, 1.5 и 2.0 нМ соответственно. Реакцию останавливали добавлением 0.5 мл 30%-ной уксусной кислоты и определяли оптическую плотность раствора при 405 нм. Концентрацию активных центров химотрипсина определяли титрованием N-транс-циннамоилимидазолом [16], трипсина я-нитрофенил-я'-гуанидинобензоатом [17]. Для определения концентрации активного ингибитора и равновесных констант ингибирования (Ki) химот-рипсин (1.0 нМ) или трипсин (1.5 нМ) инкубировали с возрастающими концентрациями ингибитора в 0.2 мл того же буфера при 37°С в течение 5 мин. Остаточную активность фермента оценивали, как описано выше. Кажущуюся Ki определяли с использованием компьютерной программы Enzfitter [18], принимая при этом, что взаимодействие ингибитора с ферментом протекает по механизму медленного компактного связывания.
Для определения pH-стабильности раствор белка (0.15 мг/мл) инкубировали в течение 20 ч при 4°С и различных значениях pH: 2.0; 4.0; 6.0; 10.0 и 12.0 (универсальный буфер Джонсона— Линдсея). По окончании инкубации пробы разводили 0.1 M трис^О-буфером, pH 8.0, (до концентрации белка 0.03 мг/мл) и определяли активность ингибитора по отношению к химотрипсину, используя в качестве субстрата СукГГФПА.
Термостабильность белка изучали при значениях pH 2.0 и 6.0. Раствор белка (0.15 мг/мл) инкубировали в течение 10 мин на водяной бане при различных значениях температур: 50, 60, 70, 80 и 90°С. Затем пробы быстро охлаждали на льду, разводили 0.1 M трис-НС1-буфером, pH 8.0, (до концентрации белка 0.03 мг/мл) и оценивали активность ингибитора по отношению к химотрипсину, как описано выше.
Влияние белка на рост и развитие макроконидий гриба Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. и зооспор оомицета Phytophthora infestans (Mont.) de Bary изучали с помощью метода, описанного в работе [19]. Количество растущих и лизированных макроконидий и зооспор и длину образующихся гиф определяли с помощью микроскопа "Laboval" (Германия). В качестве контроля использовали суспензии макроконидий и зооспор без добавления белка.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Белки с молекулярной массой 20—25 кДа выделяли из сока клубней картофеля сорта Юбилей Жукова, используя солевое осаждение (NH4)2SO4 и гель-хроматографию на колонке с сефадексом G-75, как описано в работе [4]. Эти белки разделяли с помощью ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B при pH 4.3, используя линейный градиент концентрации NaCl от 0 до 0.5 M (рис. 1). Видно, что связавшиеся с сорбентом белки разделялись на три основных компонента, обозначенных I, II и III. Все три белковых компонента обладали активностью ингибиторов протеиназ. Они эффективно подавляли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.