Ингибитор из кукурузы
на страЖе свертывания Ирови
В.А.Корнеева
Свертывание — это процесс, превращающий жидкую кровь в желеобразную массу, которая защищает нас от кровопотери при нарушении целостности сосуда. Выделяют два звена свертывания крови — сосудисто-тромбоцитарное и плазменное. В первом в основном работают эндотелий сосудов и специальные клеточные тельца — тромбоциты, которые прикрепляются к поврежденной сосудистой стенке и друг к другу, формируя в месте ранения пробку. Второе звено, плазменное, управляется каскадом белков свертывания крови — преимущественно сериновых про-теаз (ферментов, разрезающих пептидные связи), которые активируются, протеолитически расщепляя друг друга (рис.1). Процесс изменения агрегатного состояния крови может запускаться двумя способами — внешним и внутренним (контактным). Внешний путь работает, когда в кровоток в месте повреждения сосуда попадает трансмембранный белок — тканевый фактор (не будучи сери-новой протеазой, он работает как рецептор для другого белка свертывания — фУПа*). Тканевый фактор несут клетки всех
* Белки свертывания называют факторами (кратко «ф») и обозначают римскими цифрами (в порядке официального открытия). Буква «а» означает, что белок находится в активной форме.
© Корнеева В.А., 2015
Вера Анатольевна Корнеева, старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов гемостаза Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Научные интересы связаны с экспрессией рекомбинант-ных белков, регуляцией плазменного свертывания крови, ингибированием сериновых протеаз.
тканей организма, за исключением эндотелия и клеток крови, а значит, плазма взаимодействует с ним только при повреждении выстилки сосуда. Такой запуск системы свертывания физиологичен и обеспечивает остановку кровотечения. Внутренний механизм активации срабатывает при контакте крови с отрицательно заряженными поверхностями, в том числе чужеродными для организма. Тромбоз (внутрисосудистое образование сгустка, перекрывающего ток крови) — причина тяжелых заболеваний, таких как инфаркты и инсульты, с высоким уровнем смертности. К сожалению, до сих пор не существует идеального (т.е. эффективного и безопасного) антитромботического препарата, не вызывающего «перекос» системы свертывания в сторону кровотечений.
Контактная активация свертывания
Запуск плазменного свертывания по контактному пути начинается с автоактивации фактора XII при его взаимодействии с отрицательно заряженными поверхностями: in vivo — с мембраной активированного тромбоцита или бактериальной клетки, коллагеном и внеклеточными нуклеиновыми кислотами (т.е. веществами, в избытке присутствующими вблизи места повреждения сосуда); ex vivo — со стентами, катетерами и элементами сердечно-легочного шунтирования; in vitro — со стенками пластиковых и стеклянных пробирок при заборе крови. Фактор XII также может активироваться высокомолекулярным кининогеном. Его положительно заряженный домен, богатый гистидином, в присутствии ионов цинка способствует связыванию комплекса, состоящего из кининогена и фХП, с отрицательно заряженной поверхностью.
отрицательно заряженная поверхность
ТФ
гл
XII ХНа
ГЛ
XI Х1э
( ^гл
IX (Ха Villa
ГЛ
ТФ/VII VII
1Хз, Ха, тромбин
VIII
протромбин V
Ха \
V Va
V J
ю " 5 О О.
С
фибриноген
фибрин
Рис.1. Упрощенная схема каскада плазменного свертывания крови (объяснение в тексте). Внутренний, или контактный, путь активации показан красными стрелками, внешний — желтыми, общие реакции обоих путей — зелеными, положительные обратные связи — синими. Римскими цифрами обозначены факторы свертывания, буквой «а» — их активированные формы. ТФ — тканевый фактор.
В неактивной форме фХ11 — одноцепочечный полипептид с молекулярной массой 80 кДа, состоящий из нескольких доменов (рис.2). На С-конце белка расположен каталитический домен (28 кДа), а на Оконце — регуляторные домены (52 кДа), в том числе и те, посредством которых осуществляется взаимодействие с отрицательно заряженной поверхностью. При связывании с ней фактора XII конформация каталитического домена изменяется так, что в нем происходит гидролиз пептидной связи между двумя аминокислотными остатками — аргинином-353 и валином-354, результатом чего становится автоактивация фХ11. Белок разде-
ляется на тяжелую и легкую цепи (353 и 243 аминокислотных остатка соответственно), которые остаются связанными за счет дисульфидного мостика между цистеинами 359 и 486 [1]. Так образуется альфа-фХПа, который активирует фактор XI (следующего участника в каскаде ферментативных реакций плазменного свертывания), а также превращает прекалликреин в калликреин. Последний переводит в рабочее состояние фХ11 с образованием альфа-, а из нее — бета-формы (каталитического домена с массой 28 кДа) за счет протеолитическо-го расщепления. Бета-фХПа сохраняет способность активировать калликреин, но не фактор XI.
На пользу или во вред
Фактор Х!а, образовавшийся в результате работы альфа-формы фХПа, запускает расщепление следующих протеаз в каскаде плазменного свертывания — факторов К, Х и протромбина (см. рис.1). В итоге тромбин превращает фибриноген в нерастворимый фибрин и переводит в рабочее состояние фактор ХШ. Фибрин полимеризуется, образуя длинные белковые нити — фибриллы, которые ко-валентно сшиваются фактором ХШа в трехмерную сеть, препятствующую вытеканию крови из раны.
В организме при повреждении кровеносного сосуда плазменное свертывание, однако, активируется не по контактному пути, а за счет тканевого фактора. Этот трансмембранный гликопроте-ин, присутствующий на поверхности всех клеток, кроме кровяных и эндотелиальных, при образовании отверстия в сосуде контактирует с кровью. Формируется так называемый комплекс внешней теназы (тканевый фактор с фУПа), который далее расщепляет факторы К и Х, ив результате рана перекрывается фибриновым сгустком.
Роль контактной активации в гемостазе (поддержании крови в жидком виде и предотвращении и остановке кровотечений) до сих пор не вполне ясна. Дефицит фХП был впервые обнаружен
Рис.2. Структура активированного фактора XII. Белок состоит из 6 доменов: типов I и II, двух — аналогичных эпидермаль-ному фактору роста (EGF), крингл-домена (дат. kringle — разновидность кренделя; такая форма обеспечивается ß-структурами аминокислотной последовательности) и каталитического. Расщепление калликреином или автоактивация фактора XII переводят его в протеолитически активную форму, для которой фактор XI и прекалликреин — субстраты. С N^-кон-цом фактора XII могут связываться отрицательно заряженные поверхности.
в 1955 г. у Джона Хагемана (поэтому этот белок также называют фактором Хагемана). Его кровь не сворачивалась в стеклянной пробирке. Однако недостаток фХ11 не оказывает заметного влияния на гемостаз, так как пациенты и животные без фХ11 не страдают от кровотечений [2, 3].
Участие фХ11 в патологическом тромбообразо-вании было доказано экспериментально на моделях тромбоза, вызванного хлоридом железа, индуцированной коллагеном тромбоэмболии легочной артерии, лигирования аорты и острого ишемичес-кого инсульта [2, 4, 5]. Мыши с дефицитом фХ11 не отличались от здоровых животных по длительности ногтевого и хвостового кровотечений, что говорит об отсутствии у них нарушений гемостаза. В то же время мыши без фХ11 в экспериментах с индуцированным тромбозом оказались частично от него защищенными: размер тромба, объем поврежденной ткани и смертность у них были значительно ниже, чем у грызунов из контрольной группы. Повышение концентрации фХ11 в плазме экспериментальных животных до обычных значений приводило к развитию обширного тромбоза.
Как бороться
Активированный фактор XII — многообещающая мишень для создания новых антитромботических препаратов, так как сдерживание работы этого фермента не оказывает влияния на гемостаз, но позволяет предотвратить патологическое формирование сгустков при состояниях, сопровождающихся чрезмерным тромбообразованием. Крайне важно также ингибировать фХ11а при любых манипуляциях с кровью, когда она контактирует с чужеродными для организма поверхностями, вводимыми в сосуды при трансфузии, сердечно-легочном шунтировании, заборе крови. Следовательно, изучение механизмов подавления фактора Х11а и особенностей взаимодействия этой про-теазы с лучшими из существующих ингибиторов — очевидный и необходимый этап при разработке новых антитромботических средств.
Контактная активация свертывания (т.е. задействованные в ней белки — сериновые протеазы) в кровеносном русле блокируется рядом плазменных ингибиторов фХ11а, таких как С1-ингибитор, антитромбин III, а2-антиплазмин и а2-макрогло-булин. Существуют, однако, аналоги и неплазменного происхождения. Сериновые протеазы широко распространены в природе и составляют около трети всех известных протеолитических катализаторов. Они участвуют в важнейших процессах — пищеварении, оплодотворении, активации комплемента, апоптозе, иммунном ответе. Их обнаружили у представителей всех царств живых организмов. Эти ферменты играют важную роль в приспособительных реакциях прокариот к изменениям во внеклеточной среде, в питании и проникно-
вении бактерий в клетку-хозяина (инвазии). Вирулентность многих патогенных бактерий также обеспечивается сериновыми протеазами. Этим, вероятно, объясняется такое широкое распространение их ингибиторов в природе — известно 38 семейств. Благодаря тому, что каталитические центры разных сериновых протеаз схожи, «замедлителей» факторов свертывания человеческой крови находят в животных, растительных и бактериальных клетках. Уже описано 12 неплазменных ингибиторов фХПа, принадлежащих к пяти семействам, из которых только один очевидно связан с подавлением свертывания крови — четвертый домен белка инфестина (инфестин-4) из желудка кровососущего клопа Triatoma infestans [6]. Другие ингибиторы в естественных условиях не могут оказаться в контакте с кровью человека.
Природные ингибиторы фХПа — небольшие глобулярные белки с молекулярной массой от 3 до 16 кДа. Так как эволюционно они возникли не для подавления свертывания, их селективность в отношении фХПа о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.