ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 389-396
УДК 581.1
ИНГИБИТОРНЫЙ АНАЛИЗ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ/ДЕФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ В МИТОХОНДРИЯХ КУКУРУЗЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РЕДОКС-УСЛОВИЙ
© 2007 г. И. Ю. Субота, А. Ш. Арзиев, Л. П. Сенженко, В. И. Тарасенко, Ю. М. Константинов
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск Поступила в редакцию 10.07.2006 г.
Исследовано участие процесса фосфорилирования/дефосфорилирования белков в редокс-регуляции функционирования митохондрий. Инкубация изолированных митохондрий кукурузы (Zea mays L.) с [у-32Р]АТФ выявила фосфорилирование полипептидов с мол. м. 66, 60, 55, дублета 48/50, 45, 29, 22 и 19 кД. Присутствие в среде инкубации окисленного глутатиона вызывало значительное снижение уровня фосфорилирования белков. Добавление восстановленного глутатиона приводило к снижению активности фосфорилирования белков с мол. м. 60 и 48/50 кД и некоторому ее увеличению для белков 66, 55 и 45 кД. Восстанавливающий агент дитионит натрия снижал фосфорилирование белков с мол. м. 60, 45, 29, 22 и 19 кД, но увеличивал уровень фосфорилирования белка 55 кД. Ингибиторы протеинкиназ и протеинфосфатаз значительно изменяли эффекты редокс-агентов. Так, одновременное действие окислителя K3[Fe(CNy и NaF увеличивало уровень фосфорилирования белков по сравнению с обработкой этими агентами по отдельности. Обработка дитионитом натрия вместе с NaF приводила к увеличению фосфорилирования белка с мол. м. 55 кД. Фосфобелок массой около 66 кД был иммунохимически идентифицирован как белок теплового шока (БТШ 60). Полученные данные указывают на присутствие в митохондриях редокс-чувствительных протеинкиназ и протеинфосфатаз. Дифференцированное изменение профиля митохондриальных фосфобелков при воздействии различных редокс-агентов свидетельствует в пользу возможности участия фосфорилирования в передаче редокс-сигнала в растительных митохондриях.
Zea mays - митохондрии -редокс-регуляция - глутатион - фосфорилирование белков - протеин-киназы
ВВЕДЕНИЕ
В процессе эволюции высших растений произошли два различных эндосимбиотических события, и в каждое из них были вовлечены прока-риотические организмы. Первоначально эукари-отические клетки получили митохондрии через эндосимбиоз с бактериями, затем хлоропласты -из организмов, подобных цианобактериям [1]. Хотя ядра клеток в настоящее время играют основную роль в определении свойств органелл, ми-
Сокращения: БСА - бычий сывороточный альбумин; БТШ -белки теплового шока; GSH - восстановленный глутатион; GSSG - окисленный глутатион; MPT - митохондриальная мегапроницаемость (от mitochondrial permeability transition); РТР - тирозиновые фосфатазы.
Адрес для корреспонденции: Субота Ирина Юрьевна. 664033 Иркутск, а/я 317, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: 007 (3952) 51-07-54; электронная почта: subota@sifibr.irk.ru
тохондрии и пластиды имеют свои собственные геномы. Распределение генов, обеспечивающих функционирование органелл в различных ком-партментах клетки, создает значительные трудности в регуляции их экспрессии. Клетка должна координировать экспрессию генов, кодируемых ядром, присутствующих только в одной или нескольких копиях на клетку, с экспрессией генов, кодируемых органеллами и присутствующими в количестве нескольких сотен или даже тысяч копий. Одним из механизмов такого координированного контроля может быть регуляция экспрессии генов в ответ на изменения редокс-потен-циала клетки. Как известно в настоящее время, большое количество генов и метаболических путей регулируется изменениями клеточного ре-докс-статуса. Существование подобной регуляции продемонстрировано как у бактерий, так и у эукариотических организмов [2, 3]. В эукариотах механизм, модулирующий экспрессию генов в ответ на окислительный стресс или различия во
внутриклеточном редокс-состоянии, гораздо более сложен, чем в бактериях. Изменения в клеточном редокс-статусе могут модулировать активность таких транскрипционных факторов, как МуЬ и Egr-1, а также белковых конъюгатов Fos/Jun (АР-1) [3].
Известно, что фосфорилирование является одной из наиболее важных и изученных форм кова-лентной модификации белков, участвующих в регуляции транскрипции [4]. Фосфорилирование контролирует функционирование транскрипционных факторов на различных уровнях. Вызывая структурные изменения белка, фосфорилирование может изменять ДНК-связывающую активность, транс-активирующие/репрессирующие функции или компартментацию транскрипционных факторов [5, 6]. Показано, что казеинкиназа 2 (СК2) может изменять активность транскрипционного фактора CTCF, который участвует в различных аспектах регуляции генов [7]. Фактор mTERF -фосфопротеин с 4 фосфатными группами, терминирующий митохондриальную транскрипцию млекопитающих, контролируется фосфорилиро-ванием/дефосфорилированием [8]. Модификация факторов элонгации трансляции также может быть связана с их фосфорилированием. Фосфорилирование фактора EF-1 широко представлено у эукариот и играет определенную роль в регуляции трансляции [9]. Глубокому фосфорилирова-нию подвергается фактор элонгации EF-2. Фос-форилированная форма EF-2 менее активна в транслокации, чем нефосфорилированная. Учитывая масштабность указанной модификации, весьма вероятна регуляция скорости биосинтеза белка у эукариот через фосфорилирование этого фактора. В эукариотических клетках активность системы цАМФ-зависимой активации белкового синтеза коррелирует с дефосфорилированием EF-2 [9].
На молекулярном уровне механизм редокс-ре-гуляции факторов транскрипции и трансдукции сигналов пока остается не до конца понятным, хотя во многих случаях редокс-эффекты опосредуются через восстановление и окисление сульф-гидрильных групп белков [10]. Влияние редокс-агентов на пути трансдукции сигналов, связанные с активацией протеинкиназы С, может быть обусловлено присутствием множественных консервативных цистеиновых остатков в некоторых ки-назах этого типа [11], которые могут быть мишенями для редокс-регуляции. Фосфатазы также являются важным компонентом большинства сигнальных путей, так как отсутствие обратной киназной активности может прервать нормальное функционирование клеток. Как серин/трео-ниновые фосфатазы, так и тирозиновые фосфатазы (РТР) проявляют редокс-чувствительность [3]. Механизм редокс-воздействия на РТР хорошо изучен. Все без исключения РТР содержат в сво-
ем каталитическом домене высоко консервативный регион из 11 аминокислотных остатков. Как окисление, так и замена цистеинов путем направленного мутагенеза приводит к инактивации белка [12].
В настоящее время показано существование ряда фосфобелков в митохондриях эукариот. В митохондриях картофеля идентифицировано 14 фосфобелков, которые, как предполагается, участвуют в различных процессах функционирования митохондрий: в регуляции ЦТК, в активации комплекса II дыхательной цепи, в осуществлении связи между транспортом электронов и процессингом белков в комплексе III, в функционировании митохондриальных белков теплового шока. Фосфобелками являются белки теплового шока (БТШ) 90, шаперонин 60, БТШ 70 и MTSHP [13]. Ранее мы показали, что ингибиторы проте-инкиназ и протеинфосфатаз значительно модифицируют эффекты редокс-агентов на активность синтеза белка в митохондриях злаков. Была предложена схема редокс-контроля экспрессии митохондриальных генов на уровне трансляции. Согласно этой схеме, посредниками передачи ре-докс-сигнала от одного участника регуляторной цепи к другому являются протеинкиназы и проте-инфосфатазы [14]. Предполагается, что растительные митохондрии могут содержать больше протеинкиназ и протеинфосфатаз, чем митохондрии грибов и млекопитающих и, следовательно, намного больше фосфобелков, чем митохондрии других организмов [13]. Между тем, следует отметить, что участие такого широко распространенного регуляторного механизма как фосфорили-рование/дефосфорилирование белков в редокс-регуляции генетических функций митохондрий остается практически не изученным.
Целью настоящей работы было исследование влияния редокс-условий на уровень фосфорили-рования отдельных митохондриальных белков кукурузы как одного из механизмов, опосредующих регуляцию экспрессии митохондриального генома в ответ на изменения редокс-состояния органелл.
МЕТОДИКА
В работе использовали 4-дневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L., гибрид ВИР 42МВ). Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в градиенте плотности сахарозы [15]. Проростки (30 г) гомогенизировали в среде выделения, содержавшей 0.25 М сахарозу, 18 мМ KH2PO4 (рН 7.2), 5 мМ ЭДТА, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.1%-ный бычий сывороточный альбумин (БСА) при температуре 0-4°С. Соотношение количества проростков и среды выделения составляло 1 : 4 (вес :
объем). Полученный гомогенат фильтровали через капроновую ткань. Ядра и крупные клеточные фрагменты отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g. Митохондрии осаждали при 15000 g в течение 5 мин. Осадок промывали в 10 мл среды промывания (среда выделения без 2-меркаптоэтанола, рН 7.2) и подвергали повторному центрифугированию при 15000 g в течение 5 мин. После ресуспендирования в 5 мл среды промывания митохондрии подвергали очистке в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы (0.4, 0.8, 1.2 M) центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g. Митохондрии переосаждали при 15000 g в течение 10 мин.
Осадок митохондрий ресуспендировали в 2 мл буфера лизиса, содержавшего 25 мМ Трис-HCl (pH 7.8), 600 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 10%-ный глицерин, 13.5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.5 мМ фенил-метансульфонилфторид, 0.01%-ный БСА. После ресуспендирования митохондрий к смеси добавляли 10%-ный водный раствор Тритона Х-100 до конечной концентрации 0.5%. Лизат инкубировали 15 мин при температуре 4°C при постоянном встряхивании. Центрифугирование осуществляли при 15000 g в течение 15 мин. Супернатант отбирали и подвергали диализу против буфера, используемого на дальнейших стадиях очистки, в течение 1.5-2.0 ч и далее сохраняли при -20°С. Гель-фил
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.