ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 5, с. 537-564
УДК 577.158+577.352 +577.152.1
Посвящается создателю теории окисления органических соединений активированным кислородом академику А.Н. Баху
ИНИЦИИРОВАНИЕ И ИНГИБИРОВАНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОХИМИЧЕСКИХ ПЕРОКСИДАЗНЫХ СИСТЕМАХ (ОБЗОР)
© 2007 г. Д. И. Метелица, Е. И. Карасёва
Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск 220141 e-mail: metelitza@iboch.bas-net.by Поступила в редакцию 15.09.2006 г.
Обзор посвящен роли кислородных и пероксидных комплексов в монооксигеназных и моделирующих их системах, в пероксидазных и "псевдопероксидазных" процессах. Рассмотрены маршруты превращения этих промежуточных комплексов по одноэлектронному (свободнорадикальному) и двухэлектронному (гетеролитическому) механизму. Проведен анализ сопряженного пероксидазно-го окисления ароматических аминов и фенолов и рассмотрены количественные характеристики ин-гибирования и активации пероксидазных реакций: окисление пероксидазных хромогенных субстратов (АБТС, ФДА и ТМБ) в присутствии ингибиторов фенольной природы и полидисульфидов замещенных фенолов охарактеризовано константами ингибирования К в мкМ, а активация пероксидазного окисления тех же субстратов - степенью (коэффициентом) активации а в М-1, определенным для 2-аминотиазола, меламина, тетразола и его 5-замещенных производных. Приведены примеры практического использования пероксидных ферментных и модельных систем в окислении органических соединений, химическом и иммуноферментном анализе многих объектов и в тест-системах общей антиоксидантной активности биологических жидкостей.
Исследования биологической роли кислорода начались более 230 лет назад работами Лавуазье, который определял окисление как присоединение атомов кислорода к субстрату, а обратный процесс - как восстановление. В 1896 г. Бертран показал, что живые организмы содержат много ферментов, катализирующих окисление органических соединений. Эти ферменты он назвал ок-сидазами, которые каким-то образом активиру-
ют молекулярный кислород, присоединяя его, а затем окисляют субстрат.
В 1894-1897 гг. выдающийся ученый академик А.Н. Бах предположил, что кислород реагирует с акцептором А и образует органический пероксид, который затем превращает субстрат X в оксид [1, 2]:
A + O-
оксигеназа
A<
1 Принятые сокращения: АОТ - Аэрозоль ОТ или натриевая соль ди-(2-этил)гексилового эфира сульфоянтарной кислоты, ААП - 4-аминоантипирин, АБТС - 2,2'-азино-ди-(3-этил-2,3-дигидробензтиазолин-6-сульфоновая кислота), АНФ - 2-ами-но-4-нитрофенол, ГК - галловая кислота, ГПК - гидроперок-сид кумила, ГПТБ - гидропероксид трет-бутила, ОАА - общая антиоксидантная активность, ОФС - 4,4'-ди-окси-дифе-нилсульфон, ПГ - пропилгаллат, поли(АДСНФ) - поли(2-аминодисульфид-4-нитрофенол), поли(ДСГ) - полидисульфид галловой кислоты, поли(ДСПГ) - полидисульфид про-пилгаллата, поли(ДСОФС) - поли(дисульфид-4,4'-ди-окси-дифенилсульфон), ПХ - пероксидаза корней хрена, ТМБ -3,3',5,5'-тетраметилбензидин, ФДА - о-фенилендиамин, ФБ - фосфатный буфер, ФЦБ - фосфатно-цитратный буфер, АmNH2 - ароматический амин, ^ОН - фенол, 1пН -ингибиторы свободнорадикальных процессов, f - стехио-метрический коэффициент ингибирования, а - коэффициент (степень) активации пероксидазной реакции.
A
X
пероксидаза
AO + XO.
O
(1)
(2)
Ферменты, катализирующие реакции (1) и (2), были названы оксигеназами и пероксидазами соответственно.
Через два десятилетия О. Варбург предложил теорию клеточного дыхания, согласно которой этот процесс представляет собой активацию кислорода гемсодержащими ферментами, или "дыхательными энзимами" [3]. Теория О. Варбурга во многом аналогична представлениям А.Н. Баха. Следующим этапом в развитии теории биологического окисления стали работы Г. Виланда,
O
который показал, что окисление может происходить при полном отсутствии кислорода и представляет собой дегидрирование субстратов [4]:
XH2 + A
окисдение
восстановление
x + ah2.
(3)
В дальнейшем усилиями многих исследователей в разных странах было доказано, что роль окислительно-восстановительных ферментов сводится к восстановлению молекулярного кислорода одним, двумя или четырьмя электронами. В этом заключается активация кислорода ферментами, как предполагал наш великий соотечественник А.Н. Бах. Все оксидоредуктазы имеют простети-ческие группы, функцией которых является присоединение молекулы 02 и передача ей одного или нескольких электронов. Простетические группы можно разделить на две большие подгруппы: первая включает ион или комплекс переходного металла - ионы Си2+ в аскорбатоксидазе и тиро-зиназе, ионы молибдена и железа в ксантинокси-дазе, протопорфирины железа в пероксидазах, каталазах и цитохроме Р-450, который был открыт в 1958 г. независимо Гарфинкелем [5] и Клингенбергом [6] и оказался родоначальником
огромного семейства гемопротеинов, катализирующих самые разнообразные окислительные процессы; вторая подгруппа содержит в качестве простетических групп ФАД, ФМН или ФАД и ФМН вместе, а также птерины, сюда относятся оксигеназы ароматических аминокислот и многочисленные флавинзависимые монооксигеназы.
Прямое внедрение триплетной молекулы 02 (3£) в субстраты с освобождением синглетного продукта реакции невозможно, так как является спинзапрещенным. Окислителем может быть только активированный кислород в форме супероксидного аниона 02- (или Н02), пероксида водорода Н202 или образующегося из него радикала НО^ при последовательном восстановлении молекулы 02 одним, двумя или тремя электронами соответственно. Часто механизмы окисления с участием различных форм активированного кислорода противопоставляются друг другу, особенно в присутствии ионов или комплексов металлов с переменной валентностью. Однако между различными окисляющими агентами существует связь, как показано 35 лет назад на основе схемы восстановления молекулы 02 четырьмя электронами [7]:
FeOOH2+
комплекс III комплекс I комплекс II
O2 + e — O2- + e — O2- + e — [ O- + O2- ] + e — 2O2-H+J 2H+J 3H+J 2H+J
HO2 H2O2 HO + H2O 2H2O
Fe3+ J Fe3"
FeO2++ H+ H+ + HO2 FeO2+ + H+
Fe3+t
Как видно, при восстановлении 02 одним электроном образуется супероксид-анион O2-, которому соответствует в кислой среде радикал Н O2,
а в присутствии ионов Fe3+ - так называемый комплекс III (в терминологии, принятой в перокси-дазном катализе); при восстановлении 02 двумя электронами образуется Н202, а в присутствии ионов железа или его протопорфирина - комплекс I; восстановление 02 тремя электронами приводит к расщеплению связи -0-0- и образованию радикала Н O , а в присутствии ионов Fe3+ -комплекса II (Fe02+); наконец восстановление 02
четырьмя электронами приводит к образованию двух молекул воды.
Активация молекулярного кислорода ферментами или металлокомплексами осуществляется тремя путями:
1. взаимодействие 02 с ионами металлов в восстановленной форме и получение им электронов в координационной сфере металлкислородного комплекса (цитохромы Р-450);
2. взаимодействие ионов металлов с активированным двумя электронами кислородом в форме Н202 или Я00И (пероксидазы, каталазы);
3. взаимодействие 02 с восстановленными фла-винами и птеринами с образованием соединений
гидропероксидной природы, несущих активированный кислород.
Ионы металлов, флавины и птерины являются необходимыми посредниками в восстановлении кислорода электронами, поступающими от природных доноров - НАДН, НАДФН, аскорбиновой кислоты, дифенолов и т.д.
Во второй половине XX века интенсивно проводились исследования ферментных систем, активирующих молекулярный кислород и внедряющих один или два его атома в самые различные субстраты (монооксигеназы и диоксигеназы соответственно), а также их функциональных и структурных моделей, построенных в соответствии с тремя путями активации молекулярного кислорода, указанными выше. Громадный по объему экспериментальный материал, накопленный за это время за рубежом и в нашей стране, нашел отражение и обобщен в трудах многочисленных международных симпозиумов и конференций, обзорах и монографиях, часть которых [8-24] стала основой первого раздела данного обзора, посвященного монооксигеназным ферментным системам и их моделям (1970-1990 гг.). Вторая и третья часть обзора посвящены механизмам действия пероксидазных и "псевдопероксидаз-ных" систем с акцентом на соотношение и роль гетеролитических и гемолитических стадий распада пероксидных комплексов пероксидаз, инициирование и ингибирование свободнорадикаль-ных процессов окисления субстратов разного строения и опираются, в первую очередь, на экспериментальные данные нашей лаборатории, полученные в 1990-2005 гг.
Мы цитировали только работы обобщающего характера и лишь те оригинальные статьи, которые имели приоритетное значение, но главной целью обзора было отражение роли кислородных и пероксидных комплексов ферментов-мо-нооксигеназ и их моделей, пероксидаз и "псевдо-пероксидаз" и механизмов превращения этих комплексов, а также действия окисляющих агентов разной природы.
По нашему мнению, рассмотренные данные подтверждают ту большую роль промежуточных комплексов кислорода, пероксидов и гидроперок-сидов ферментов-оксидоредуктаз и их моделей, которую впервые декларировал академик А.Н. Бах в своей теории медленного окисления органических веществ [1, 2].
МОНООКСИГЕНАЗНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ И ИХ МОДЕЛИ
Новый тип оксидоредуктаз, названных моно-оксигеназами, или оксидазами, со смешанной функцией, был открыт в 1955 г. Мейсоном [25] и
Гаяиши [26]. Монооксигеназы требуют обязательного присутствия восстановленных пиридин-нуклеотидов - НАДФН или НАДН и окисляют различные субстраты, внедряя в них один атом из молекулы 02 и восстанавливая до воды другой:
АН + НАДФН + 02 + Н+ —► А0Н + НАДФ+ + Н20,
где АН - субстрат, А0Н - продукт реакции.
Монооксигеназы широко распространены в природе, входят в состав микросомальной фракции клеток печени человека и млекопитающих и ответственны за метаболизм стероидов, проста-гландинов и громадного числа ксенобиотиков (канцерогены, лекарства, наркотики и др.). В коре надпочечников локализована стеро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.