ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 3, с. 296-303
= ЭКОЛОГИЯ
УДК 591.2
ИНСЕКТИЦИДНОЕ И ИММУНОСУПРЕССИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ АСКОМИЦЕТА Cordyceps militaris НА ЛИЧИНОК КОЛОРАДСКОГО ЖУКА Leptinotarsa decemlineata
© 2014 г. В. Ю. Крюков, О. Н. Ярославцева, И. М. Дубовский, М. В. Тюрин,
Н. А. Крюкова, В. В. Глупов
Институт систематики и экологии животных СО РАН, 630091 Новосибирск, ул. Фрунзе, 11
E-mail: krukojf@mail.ru Поступила в редакцию 23.03.2013 г.
Впервые установлено иммуносупрессивное и инсектицидное действие культуры энтомопатогенно-го гриба Cordyceps militaris на личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata. Обнаружено, что пероральное действие культуры гриба приводило к дозозависимому снижению выживаемости, отставанию роста, задержке линьки, снижению общего числа гемоцитов, повышению активности фе-нолоксидаз в гемолимфе и снижению активности фермента в кутикуле, а также к повышению чувствительности личинок к грибу Beauveria bassiana на уровне синергистического эффекта.
DOI: 10.7868/S0002332914020040
Энтомопатогенный гриб Cordyceps militaris (L.: Fr.) Fr. представляет интерес как источник биологически активных веществ и как один из факторов регуляции численности насекомых-филлофагов. Гриб активно изучается в биотехнологической и медицинской областях, при этом биология гриба и его патогенная стратегия в настоящее время изучены слабо (Shrestha et al., 2012). Проведено множество исследований влияния как целого гриба, так и его экстрактов и отдельных метаболитов на позвоночных животных, их физиологические системы, органы, ткани и клетки (Holliday, Cleaver, 2008; Paterson, 2008). Было показано, что гриб не содержит последовательностей, кодирующих токсины, опасные для человека (Zheng et al., 2011). В то же время лишь в единичных работах было описано воздействие C. militaris и его метаболитов на насекомых. Ряд исследователей охарактеризовали развитие плодовых тел гриба на насекомых при инъекциях или топикальном заражении различными типами спор (Shrestha et al., 2012). Токсический эффект культурального фильтрата гриба был показан для личинок комаров (Belloncik, Parent, 1976; Bellon-cik, Gharbi-Said, 1977). Было установлено инсектицидное действие метаноловых экстрактов C. militaris и их основного компонента кордицепина на личинок капустной моли Plutella xylotella L. (Kim et al., 2002). Однако физиологические реакции насекомых при развитии инфекции или действии метаболитов C. militaris остаются неизученными.
Интегральные показатели физиологического состояния насекомых — вес и время прохождения стадий онтогенеза. Важнейшие механизмы рези-
стентности насекомых к энтомопатогенам включают системы клеточного и гуморального иммунитета (инкапсуляция, фагоцитоз, фенолоксида-зы (ФО), антимикробные белки и т.д.) (Hajek, Leger, 1994; Bulet et al., 1999; Lavine, Strand, 2002), обусловливающие элиминацию патогенов, а также деградацию токсичных продуктов их метаболизма (Dubovskiy et al., 2012). ФО вносят существенный вклад в реализацию защитных противогрибковых реакций за счет меланизации грибных гифальных тел в кутикуле и гемоцели (Hajek, Leger, 1994). Кроме того, меланин и ряд продуктов, образующихся в ходе его синтеза, высокотоксичны для грибов (St. Leger et al., 1988). Важнейшую роль в координации данных процессов играют гемоциты (клетки крови) насекомых, особенно клетки иммунокомпетентного звена — плазматоциты и гранулоциты (Pech, Strand, 2000). Следует отметить, что для подавления реакций клеточного и гуморального иммунитета хозяев, а также сдерживания развития сопутствующей микрофлоры энтомопатогенные грибы используют ряд токсинов. Однако большинство данных получено для генерализированных энтомопато-генных грибов Metarhizium, Beauveria, Isaria, Aspergillus (Charnley, 2003), а не специализированных, таких как C. militaris.
Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say (Coleoptera: Chrysomelidae) активно изучается как объект биологического контроля. Из микробиологических агентов против колорадского жука используют грибы Beauveria, Metarhizium, Isaria и препараты на основе бактерий Bacillus thuringien-sis. В настоящее время показана наибольшая пер-
спективность разработки комбинированных препаратов на основе смесей энтомопатогенных грибов с бактериями (Wraight, Ramos, 2005; Kryukov et al., 2009), химическими инсектицидами (Furlong, Groden, 2001; Dubovskiy et al., 2010), вторичными метаболитами растений (Крюков и др., 2012б). Кроме того, определенная перспектива для управления численностью насекомых — использование биопрепаратов на основе метаболитов грибов, например деструксинов (Thomsen, Eilenberg, 2000) или авермектинов (Штерншис, 2010).
Цель работы — исследование влияния твердофазной культуры (TK) С. militaris на динамику выживаемости, особенности развития, показатели иммунитета личинок колорадского жука, а также оценка чувствительности личинок к грибу Beau-veria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. под воздействием TK С. militaris.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Были использованы изоляты C-20 C. militaris и Sar-31 B. bassiana из коллекции микроорганизмов Института систематики и экологии животных СО РАН. Культуры сохраняли на среде Сабуро (Бой-кова, Новикова, 2001) при 4° С и пересевали 1 раз в год.
Для получения ТК С. militaris использовали среду из пшена, риса и сушеного бокоплава (Gam-marus) в весовом соотношении 50 : 50 : 4 соответственно. Рис и пшено подогревали в воде 8—10 мин до кипения. Затем воду сливали и зерно автокла-вировали при давлении 101.3 кПа в течение 20 мин. После этого ингредиенты смешивали, добавляли гаммарус, раскладывали по чашкам Петри (диаметр 150 мм, высота слоя среды 3—4 мм) и автоклавировали повторно при давлении 101.3 кПа в течение 25 мин. Полученную среду инокулировали глубинной культурой (7 мл на 1 чашку), предварительно выращенной на среде Чапека с пептоном (0.4%) при 130 об./мин в течение 6 сут. Инкубацию ТК проводили при 25°С и 10-часовом световом дне в течение 4.5 нед до появления зачаточных стром гриба. Полученную культуру сушили 2 нед при 25°С, затем измельчали на шаровой мельнице. Для установления содержания кордицепина в ТК проводилась ее экстракция водой под действием ультразвука с последующим хромотографическим анализом (Крюков и др., 2012а). Содержание кордицепина в ТК при водной экстракции составило 7 ± 0.2 мг/г. Для инактивации конидий ТК подвергали 30-минутному воздействию высоких температур (85°С). Термически обработанную ТК суспендировали в воде с Тween 20 (0.03%) (Sigma, США) и использовали для обработки насекомых.
Конидии C. militaris и B. bassiana были получены на среде Сабуро. Для обработки насекомых конидии были суспендированы в стерильной воде с Tween 20 (0.03%). Титры конидий определяли с помощью гемоцитометра.
Личинки колорадского жука были собраны на частных картофельных полях Новосибирской обл. В экспериментах были использованы личинки возрастов III и IV. Обработанных и нативных личинок содержали в пластиковых контейнерах объемом 300 мл по 10 экз. при 25°С, 80-90%-ной относительной влажности, 12-часовом световом дне и кормили листьями картофеля.
Листья картофеля и насекомых возрастов III и IV обрабатывали 0.625, 1.25, 2.5 и 5%-ной суспензиями ТК. Листья погружали в суспензии ТК на 30 с, высушивали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем однократно скармливали личинкам, из расчета 5 ± 0.25 г листьев на одну по-вторность (10 личинок). Также проводили перку-танную обработку — погружение насекомых в суспензии TK на 10 с (2 мл суспензии на одну повторность с 10 насекомыми).
Заражение жизнеспособными конидиями C. militaris проводили на личинках возрастов III и IV как перкутанным, так и пероральным способами (титр — 1 х 108 конидий/мл) аналогично методике, описанной выше для ТК.
Водный раствор кордицепина (Fluka, Швейцария) скармливали личинкам возраста III вышеописанным способом в концентрации 0.035%, что соотносится с 5%-ной концентрацией ТК.
При изучении совместного действия ТК и конидий B. bassiana личинки возрастов III и IV были инфицированы методом погружения в водную суспензию конидий B. bassiana и сразу помещены на корм, обработанный суспензией ТК. Для возраста III испытывали дозы ТК — 1% и B. bassiana — 1 х 106 конидий/мл, а для возраста IV — ТК — 2.5% и B. bassiana — 5 х 105 конидий/мл.
Во всех указанных биотестах смертность и массу насекомых учитывали на протяжении 10 сут. В каждом варианте опытов было использовано не менее 30 насекомых (три повторности по 10 насекомых).
Эксперименты по иммунитету насекомых проводили только при скармливании ТК. Использовали личинок возраста IV, чтобы исключить влияние линьки и возрастного полиморфизма.
Для подсчета общего числа гемоцитов через 3 сут после обработки у личинок брали 5 мкл гемолимфы и смешивали с 30 мкл антикоагулянта (62 мМ NaCl, 100 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 30 мМ цитрата натрия, 26 мМ лимонной кислоты, рН 4.6), содержавшего фенилтиомочевину (0.4%), с последующим подсчетом в гемоцито-метре. Для типирования гемоцитов их суспензию
Динамика линьки личинок колорадского жука при переходе с возраста III на возраст IV после скармливания твердофазной культуры (TK) С. militaris
ТК, %
Личинки (%), перелинявшие в возраст IV, по суткам
1 2 3 4 5 6
Контроль 27 49 85 100 100 100
0.625 25 42 92 100 100 100
1.25 11 29 52* 69* 100 100
2.5 0* 14* 52* 69* 78* 92
5 0* 3* 3* 8* 18* 11*
: P < 0.05 по сравнению с контролем.
Для сравнения динамики смертности насекомых использовали тест Каплана—Майера (Sigma-Stat 3), для сравнения соотношения перелинявших и неперелинявших личинок — х2-тест. Вес насекомых и показатели иммунитета были проанализированы с помощью One-way ANOVA (STATISTICA 6.0), достоверность отличий определяли с помощью критерия Тьюки. Значения на графиках представлены в виде средних арифметических и их ошибок (SE). Для анализа аддитивных и синергистических взаимодействий патогенов использовали биноминальный тест, основанный на сравнении ожидаемого и наблюдаемого уровней смертности (Tounou et al, 2008).
капали на предметное стекло (по 10 мкл) и инкубировали во влажной камере при комнатной т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.