ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 3, с. 363-369
_ ГЕНЕТИКА _
РАСТЕНИЙ
УДК 575.222.73:[633.1+633.14]
ИНТРОГРЕССИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ЭГИЛОПСА В ГЕНОМ ГЕКСАПЛОИДНЫХ ТРИТИКАЛЕ
© 2007 г. О. А. Орловская, Л. Н. Каминская, Л. В. Хотылева
Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072; факс: (375-17)284-19-17; e-mail: L.Koren@igc.bas-net.by Поступила в редакцию 31.03.2006 г.
Проведен цитологический анализ различных стадий мейоза грибридов F4 в сравнении с гибридами Fj, полученными от скрещивания гексаплоидных тритикале с геномно-замещенными формами пшеницы Авролата (AABBUU), Аврозис (AABBSshSsh), у которых геном D мягкой пшеницы Аврора замещен соответственно на геномы Aegilops umbellulata, Ae. sharonensis. Показано, что в F4 уровень бивалентной конъюгации превышает теоретически ожидаемый. Однако значение мейотического индекса у гибридов F4 все еще незначительно, что свидетельствует о незавершенности процесса стабилизации мейоза, в частности стадий, следующих за метафазой I. На основании морфологического и биохимического анализов полученных гибридов выделены формы тритикале, имеющие некоторые признаки рода Aegilops, представляющие интерес для генетико-селекционных исследований.
Получение новых гибридных форм злаков на основе отдаленной гибридизации позволяет расширить их генетическое разнообразие. Синтетические амфидиплоиды, включающие в себя геномы различных видов злаков, могут значительно облегчить передачу ценных свойств генетического материала дикорастущих видов культурным растениям [1, 2]. В научной литературе обсуждается возможность использования потенциала рода Aegilops Ь. для генетического улучшения культурных злаков [3-6]. Нами экспериментально проверен новый способ расширения и улучшения генофонда тритикале посредством интрогрессии генетического материала эгилопса в геном гекса-плоидных тритикале с помощью использования в скрещиваниях геном-но-замещенных форм пшеницы Авролата (ААВ-Вии), Аврозис (AABBSshS8Ь), у которых геном D мягкой пшеницы Аврора замещен соответственно на геномы Aegilops итЬе1ЫаТа, Ае. sharonensis [7]. В наших предыдущих работах установлено, что характер поведения хромосом в мейозе у гибридов F1 способствует интрогрессии чужеродного генетического материала в геном гексаплоидных тритикале [8]. Данные морфологического и биохимического анализов гибридного материала F1 в сравнении с родительскими формами, описанные ранее, позволили выявить маркеры отдельных хромосом Aegilops (первой, второй, третьей, шестой и седьмой групп гомеоло-гичных хромосом), которые могут быть использованы для идентификации чужеродного генетического материала [9].
Цель данной работы - исследовать поведение хромосом в мейозе у гибридных растений F4 по сравнению с Р] и исходными гексаплоидными тритикале; изучить интрогрессию генетического материала эгилопса в продвинутых поколениях гибридов, полученных от скрещивания гексаплоидных тритикале с геномно-замещенными формами пшеницы, и проследить закономерности наследования признаков эгилопса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили гибриды Р4 пяти комбинаций скрещивания (Альмо X Авролата, Альмо X Аврозис, Уго X Авролата, Уго X Аврозис, Модуль X Авролата), полученные самоопылением гибридов от скрещивания озимых гексаплоидных сортов тритикале (Альмо, Уго, Модуль) с геномно-замещенными формами пшеницы Авролата (ААВВии), Аврозис (AABBSshSsh), у которых геном D мягкой пшеницы Аврора замещен соответственно на геномы Aegilops umbellu-lata, Ae. sharonensis. Данные формы пшеницы созданы Е.Г. Жировым в Краснодарском НИИСХ им П.П. Лукьяненко и были любезно предоставлены нам для работы [10].
Для выявления интрогрессии чужеродного генетического материала в растениях гибридов Р4 проведены цитологический, морфологический, биохимический анализы в сравнении с исходными родительскими формами. Анализировали следующие морфологические признаки: окраска соломины, форма и окраска колоса, остистость, опушение колосковой чешуи, ломкость колоскового
Число, шт. 25
20
15
10
0
Рис. 1. Конъюгация хромосом в метафазе I у гибридов F1, F4 и исходных форм тритикале. 1 - закрытые биваленты, 2 - открытые биваленты, 3 - всего бивалентов, 4 - униваленты.
стержня, жесткость колосковой чешуи, восковой налет на колосе.
Изучение микроспорогенеза проводили на временных давленых препаратах. Колосья извлекали до выхода из листового влагалища, чтобы уловить все стадии мейоза, и фиксировали их в смеси этанол-уксусной кислоты (3 : 1). Через сутки после фиксации материал переводили в 70%-ный спирт, где он хранился до анализа. В качестве красителя использовали 2%-ный ацетоор-сеин. Для каждой комбинации скрещивания и исходной формы изучали по 30 пластинок метафа-зы I и по 50 пластинок следующих стадий мейоза: анафазы I и II, диад, метафазы II, тетрад. Исследование препаратов проводили на микроскопах МБС-10 и Amplival.
Электрофоретический анализ глиадинов изучаемых гибридов и исходных форм осуществляли по методике ISTA (International Seed Testing Association) с тем отличием, что в качестве растворителя вместо хлорэтанола использовали 70%-ный этанол. Глиадины извлекали из одной целой зерновки (весом 20-45 мг) с помощью 0.5 мл 70%-ного этанола. Экстракцию глиадина проводили при температуре 4°C в течение 15-18 ч. Центрифугировали 10 мин при максимальной скорости на центрифуге Опи-8. С помощью микропипетки наносили на гель электрофореза 15 мкл смеси белкового экстракта исследуемого образца с равным объемом 0.001%-ного раствора метилового зеленого в 50%-ном растворе сахарозы на электродном буфере (0.0053 М глицина и 0.07 М уксусной кислоты, pH 3.2). Разделение белка проводили в течение 6 ч при напряжении 350В в блоке 120 х 120 х 5 мм в 10%-ном полиакрила-мидном геле с 1М мочевиной. Для окрашивания белков использовали 0.05%-ный раствор Кумасси G-250 в 7%-ном растворе уксусной кислоты в те-
чение 12 ч. Гель с проявленными электрофорети-ческими спектрами фотографировали на пленку микрат-изопан в проходящем свете негатоскопа Н-48 при максимальной и минимальной интенсивности освещения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительный анализ микроспорогенеза гибридов тритикале F4 и F1
Хорошо известно, что у отдаленных гибридов мейоз протекает ненормально, у некоторых растений образуются мультивалентные ассоциации, в других образуются униваленты, а в третьих - и униваленты, и мультиваленты [11]. В литературе встречаются сообщения о нарушениях в процессе мейоза у гибридов от скрещивания разных видов эгилопса с пшеницей [12]. В данном исследовании мы провели сравнительный анализ поведения хромосом в мейозе у гибридов тритикале Б4 и Б1, включающих Aegilops. У гибридов Б4 анализировали процесс конъюгации хромосом отдельных семей пяти комбинаций скрещивания (Альмо х х Авролата, Альмо х Аврозис, Уго х Авролата, Уго х Аврозис, Модуль х Авролата), выделенных на основании различий по морфологическим признакам.
Сравнительный анализ поведения хромосом в М1 гибридов тритикале четвертого и первого поколений показал, что к Б4 происходит увеличение количества бивалентов на материнскую клетку пыльцы (МКП). Если в среднем в число бивалентов на клетку составляет 15.72, то в Б4 данный показатель возрастает до 19.46, а число закрытых бивалентов соответственно равно 12.36 и 15.35 (рис. 1). У большинства исследуемых семей этот показатель в Б4 приближается к таковому материнских форм. Изменения характерны и для диапазона варьирования хромосомных ассоциаций. В
он составил от 11"20' до 19''4', в то время как в Б4 15"12'-21". Согласно полученным данным, наибольшее число закрытых бивалентов как в Б4, так и в Бх наблюдается у гибридов комбинации Уго х х Авролата, а наименьшее - у гибридов Модуль х х Авролата. При сравнении числа открытых бивалентов в Б4 и Бх видно, что к четвертому поколению оно возрастает в 1.2 раза, в то время как размах варьирования сохраняется тот же - от 0 до 9 открытых бивалентов на МКП. Наиболее значительные различия между гибридами Б4 и Бх наблюдались по числу унивалентов на МКП. Данный показатель резко падает к четвертому поколению (рис. 1). Так, в среднем в р! наблюдали 10.91 унивалентов на клетку, а в Б4 - только 2.70 унивалента. Кроме того, изменяется и размах
варьирования этого показателя: для гибридов Р1 -от 4 до 20, для Р4 - от 0 до 12.
Таким образом, анализ характера поведения хромосом в М1 мейоза гибридов Р4 и Р1 в процессе интрогрессии хромосом эгилопса в геном тритикале выявил достаточно высокую степень бивалентной конъюгации, что может быть обусловлено использованием геномно-замещенных форм пшеницы в качестве источника чужеродного генетического материала, создающих условия не только для гомологичной, но и для гомеологич-ной конъюгации хромосом.
Анализ поведения хромосом в метафазе I гибридов тритикале Р4 выявил достаточно высокую степень бивалентной конъюгации и снижение доли унивалентов. Если исходить из положения, что образующиеся в метафазе I униваленты являются основной причиной аномалий на последующих стадиях мейоза [13], то в нашем случае следует ожидать незначительное количество таких аномалий у полученных гибридов. Оценка спектра нарушений в А1 гибридов Р4 и Р1 выявила сокращение количества МКП с нарушениями к четвертому поколению (рис. 2). У изученных растений Р4, по сравнению с таковыми Р1, модальный класс составляют МКП с меньшим числом отставших хромосом. Для гибридов Альмо X Аврозис и Уго X Аврозис - это МКП с одной отставшей хромосомой (13.78 и 19.96% соответственно), а для остальных - с двумя. Однако, несмотря на обнаруженную в ряду поколений относительную нормализацию анафазного расхождения хромосом, количество аномальных МКП в Р4 на стадии анафазы I достаточно велико и составляет в среднем для изученного материала 72.28% с вариацией по комбинациям скрещивания от 61.95 (Уго X Авро-лата) до 85.84% (Уго X Аврозис). Одна из причин такого количества аномалий заключается в дисфункции веретена деления.
Отставшие в анафазе I хромосомы, как правило, задерживаются в цитоплазме и формируют микроядра на стадии интеркинеза. Для гибридов как Р4, так и Р1 отмечен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.