БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2009, том 35, № 6, с. 761-778
УДК 577.27'112.825
ИНЖЕНЕРИЯ АНТИТЕЛ: МОЛЕКУЛЯРНЫЙ КОНСТРУКТОР НА ОСНОВЕ МОДУЛЯ БАРНАЗА-БАРСТАР
© 2009 г. С. М. Деев#, Е. Н. Лебеденко
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 19.05.2009 г. Принята к печати 29.05.2009 г.
Инженерия антител для клинического применения на сегодняшний день представляет собой бурно развивающуюся область науки и большой бизнес. Основные функции антитела могут быть пространственно разграничены и отнесены к отдельным доменам молекулы, поэтому каждый из них может быть объектом для конструирования с целью использования определенной функции иммуноглобулина. В этом смысле потенциал молекул иммуноглобулинов совершенно уникален. В настоящем обзоре кратко описаны достижения и проблемы инженерии антител. Основное внимание сконцентрировано на молекулярном конструкторе, позволяющем с помощью универсального модуля барназа-барстар получать моно- и мультивалентные мини-антитела и их производные с заранее заданными свойствами.
Ключевые слова: одноцепочечные антитела, мулътивалентностъ, биспецифичностъ, направленная доставка; модулъ барназа-барстар.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время антитела занимают второе место на фармацевтическом рынке по объему производства после вакцин. Более 85% разрешенных для клинического применения антител являются продуктами инженерии антител, к ним относятся химерные, гуманизированные и полностью человеческие мкАТ, антитела, полученные с помощью фагового дисплея, генно-инженерные конъюгаты антител с цитокинами и токсинами. Реализовать уникальный потенциал иммуноглобулинов, имеющих модулярную структуру и набор функций, связанных с отдельными структурными модулями, и модифицировать их для самых различных клинических применений удалось благодаря технологиям генетической и клеточной инженерии. В стадии клинических испытаний находятся сотни производных антител, включающих антитела неприродного формата, полученные генно-инженерными способами: биспецифические антитела, одноцепочечные полноразмерные антитела, различные варианты укоро-
Сокращения: АЗКЦ - антителозависимая клеточная цито-токсичность; КЗЦ - комплементзависимая цитотоксичность; мкАТ - моноклональные антитела; Ch и Cl - константные домены тяжелой и легкой цепей антитела; Fab - антигенсвя-зывающий фрагмент антитела; Fc - константный (кристаллизующийся) фрагмент антитела; FcyR - клеточные рецепторы Fc-фрагментов антител класса G; FcRn - неонатальный рецептор Fc-фрагментов антител; HER1 (EGFR) и HER2/neu -раковые маркеры группы тирозинкиназных рецепторов; IgG - иммуноглобулин класса G; scFv - одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела; Vh и Vl - вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела. # Автор для связи (тел.: 495-429-88-10; эл. почта: deyev@ibch.ru).
ченных антител, в том числе димеры и мономеры Fab-фpaгмeнтoв, scFv-фрагменты (одноцепочечные мини-антитела), однодоменные антитела (наноанти-тела) и др. В то же время разработка отдельного специфичного и высокоэффективного антитела для клинического применения остается сложной и трудоемкой задачей. В зависимости от конкретного применения необходимо изменять размер антител, их специфичность, аффинность, валентность, уменьшать иммуногенность, оптимизировать фар-макокинетические свойства и эффекторные функции. В дополнение к этому, для увеличения эффективности воздействия, в состав рекомбинантных антител включают антитела другой специфичности (биспецифические мкАТ), действующие или диагностические агенты, например, цитокины, белковые токсины и радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные белки и т.д.
В настоящем обзоре внимание будет сконцентрировано на разработанном нами молекулярном конструкторе, позволяющем с помощью универсального модуля барназа-барстар получать моно- и мультивалентные мини-антитела и их производные с заранее заданными свойствами.
1. СТРУКТУРНЫЕ ДОМЕНЫ АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ
Природные антитела или иммуноглобулины являются компонентом иммунной системы, предназначенным для распознавания и удаления чужеродных антигенов. Это сложные белки с выраженной доменной организацией и набором различных функ-
ций. На рис. 1 структура иммуноглобулина показана на примере IgG, составляющего более 65% от общего количества антител в сыворотке крови человека. Огромное разнообразие антител (теоретически возможное число комбинаций 109-1011) заложено в мозаичном строении генов тяжелой и легкой цепей и возникает в результате перегруппировок ДНК и последующих соматических мутаций в процессе созревания иммунных клеток [1]. Нами уточнен детальный механизм перегруппировки генов в каппа-локу-се легких цепей иммуноглобулинов человека [2], нашедший полное подтверждение в ведущих лабораториях мира и являющийся сейчас общепризнанным [3, 4].
Структурные домены иммуноглобулина не только обособлены генетически и пространственно, но и выполняют разные функции в процессе иммунного ответа (рис. 1).
Индивидуальное антитело обладает уникальной специфичностью и высоким сродством к своему антигену (äd 10-8-1011 M), благодаря комплементар-ности антигенсвязывающего участка антитела определенному фрагменту молекулы антигена (эпи-топу) (рис. 1, функция 1). Каждый антигенсвязываю-щий участок сформирован двумя вариабельными доменами VH и VL, принадлежащими соответственно тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина. Исключение составляют только некоторые виды антител у семейства Camelidae и акул, у которых отсутствует легкая цепь и за взаимодействие с антигеном отвечает только VH-домен [5].
Константная часть иммуноглобулина состоит из одного домена у легких цепей (CL) и трех или четырех доменов (в зависимости от класса антител) у тяжелых цепей (CH). Гидрофобные участки на границе СН1- и СН2-доменов сохраняют относительную подвижность, образуя шарнирную область, обеспечивающую смещение Fab-фрагментов (англ. Fab - antigen binding fragment) и их вращение вокруг шарнира. Способность антител связывать одновременно два антигена определяется их сложной пространственной структурой, стабилизированной дисульфидны-ми связями, а также наличием шарниров, облегчающих точную "подгонку" при одновременном связывании двух антигенов (рис. 1, функция 1). Бивалентность природных иммуноглобулинов значительно увеличивает их функциональную аффинность (авидность) и время удерживания на поверхностных клеточных рецепторах и других поливалентных антигенах.
Константная часть IgG содержит участки связывания с белком системы комплемента C1q и клеточными рецепторами Fc-фрагментов (FcyR), опосредующими эффекторные (вторичные) функции иммуноглобулинов, то есть их способность убивать клетки-мишени, запуская механизмы антителоза-висимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ; англ. ADCC - antibody dependent cellular cytotoxicity)
(рис. 1, функция 2) и комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ; англ. CDC - complement-dependent cytotoxicity) (рис. 1, функция 3). Константные домены тяжелых цепей, как правило, гликозилиро-ваны. Состав углеводного компонента иммуноглобулинов высоко видоспецифичен, а также варьирует внутри вида. От состава углеводного компонента зависит эффективность связывания константной части IgG с рецепторами FcyR, опосредующими эф-фекторные функции.
Способность константной части иммуноглобулинов G и М связываться с неонатальным Fc-рецепто-ром (FcRn) играет важную роль в контроле уровня антител в сыворотке крови и защите их от катаболизма в лизосомах эндотелия сосудов. Механизм защиты IgG от катаболизма основан на связывании антител с FcRn в лизосомах при рН 6.0 и возврате их в кровоток, где при рН 7.2-7.5 комплекс распадается (рис. 1, функция 4). Кроме того, FcRn отвечает за перенос IgG через эпителиальный и эндотелиальный барьеры, в частности, за передачу иммуноглобулинов от матери ребенку.
Таким образом, антитела, которые вырабатывает организм при иммунном ответе, могут включать сразу несколько клеточных механизмов удаления чужеродного антигена и целый каскад биохимических реакций, предназначенных для этой цели. Основные функции антитела могут быть пространственно разграничены и отнесены к отдельным доменам молекулы. Поэтому каждый домен может быть объектом для биоинженерии с целью использования (усиления/ослабления) определенной функции иммуноглобулина (рис. 2). В этом смысле биоинженерный потенциал молекул иммуноглобулинов совершенно уникален. На сегодняшний день инженерия антител для клинического применения представляет собой бурно развивающуюся область науки и большой бизнес (см. обзор [6]). За последнее десятилетие осуществлен значительный прорыв в познании функций константной части и углеводного компонента иммуноглобулинов, созданы новые клеточные технологии получения полноразмерных гуманизированных и полностью человеческих антител с заданным типом гликозилирования [7-13]. Какова же наша ниша в области инженерии антител и в чем ее уникальность?
2. ИНЖЕНЕРИЯ АНТИТЕЛ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПРОБЛЕМЫ
Начало современной инженерии антител положила гибридомная технология, предложенная Кёле-ром и Мильштейном в 1975 г. [14]. Клеточная линия, гибридома, которую получают в результате слияния иммунных лимфоцитов, синтезирующих антитела нужной специфичности, с бессмертной миеломной линией, секретирует моноклональные антитела (мкАТ), то есть антитела одного вида, специфичные к антигену, использованному для иммунизации.
trt S О О ч
ч >
д
Д л
м
о >
»
X Д
Д
ON
к> о о
NO
Fv
Fab
3.0x6.5 нм dc 6.0 нм
шарнир
Fc
6.5 х 6.0 нм d„ 5.8 нм
Активация клеток-киллеров
Реакции воспаления
Углеводный компонент антитела
) I сук
V [ Антитело, специфичное к х рецепторам клетки-мишени I* жПоверхностные рецепторы I I Тклетки-мишени Продукты каскада реакций комплемента
рН 7.5
Рис. 1. Структурные единицы антител и их функции как объекты инженерии.
Структурные единицы: Fv - вариабельный фрагмент, состоящий из вариабельных доменов легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, в каждом вариабельном домене черным выделены три гипервариабельные об
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.