ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ, 2013, том 47, № 1, с. 18-22
УДК 576:(541.18+666.1)
ИНЖЕНЕРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОВЕРХНОСТИ СТЕКЛА
© 2013 г. |П. Д. Саркисов|, Е. Г. Винокуров, Н. Б. Градова, Е. С. Бабусенко, В. В. Бондарь*
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва *Всероссийский институт научной и технической информации РАН, Москва
vin@muctr.ru Поступила в редакцию 01.10.2012 г.
Изучена возможность реализации нового направления — биотехнологической инженерии поверхности стекла. Исследован рост и плотность закрепления на поверхности стекла различных культур диатомовых водорослей. Представлены экспериментальные результаты подтверждающие возможность биоинженерного формирования микро- и наноструктуры поверхности стекла с помощью диатомовых водорослей.
БОТ: 10.7868/80040357113010120
ВВЕДЕНИЕ
Биологические технологии являются актуальной возможностью создания наноматериалов. Так, например, механизм биосинтеза кремнистых наноструктур диатомовыми водорослями дает возможность создания разнообразных наномате-риалов.
Диатомовые водоросли, материал створок которых близок к плавленому кварцу [1], предлагается применять в качестве источника кварца [2]. Диатомовые водоросли также используют в качестве биореакторов для получения органических веществ [3], сорбентов, предназначенных для выделения высокочистых веществ [4] или заполнения каталитически активным диоксидом титана [5, 6]. Из кремнистых диатомовых створок получают реплики из золота, углерода и др. Кремнезем створок также превращают в кремний с размером нанокристаллов 2—5 нм, которые могут быть использованы в качестве сенсоров газов [6]. Культивирование диатомей проводят в контролируемых условиях в фотобиореакторах [7]. Активно проводится исследование механизмов транспорта кремния диатомовыми водорослями [8]. Диатомеи имеют скелеты, состоящие из наноча-стиц диоксида кремния с размерами 20—400 нм, которые самоформируются в процессе биосили-фикации. Этот процесс управляется с помощью специальной программы, записанной в генетическом коде протеинов, ответственных за выделение кремния из морской воды с растворенными в ней примесями при нормальных условиях [9]. В осаждении кремния участвуют силаффины — пептиды, катализирующие поликонденсацию кремниевой кислоты [10]. Предполагается, что различия в орнаментации панциря и размерах кремни-
стых наноструктур связаны с видовым различием силлафинов диатомей [11, 12].
В биологических системах макромолекулы осуществляют строгий контроль над образованием ядер кристаллизации неорганического вещества, стабилизацией фаз, процессами сборки и формирования пространственных структур [13, 14]. Характерной чертой живых систем является селективность и способность к узнаванию на молекулярном уровне. Биологические системы способны собирать строительные блоки размером в несколько нанометров в функционально сложные структуры. К примеру, белки диатомовых водорослей способны вызывать образование ядер кристаллизации неорганических соединений. Этот процесс четко организован в пространстве и во времени.
Важнейшими моментами при исследованиях в области биологической самоорганизации являются: определение совместимости и выбор подходящих комбинаций биологических и неорганических материалов; синтез соответствующих структурных блоков; понимание механизма самоорганизации структурных блоков и контроль над этим процессом.
Поскольку растворенный в окружающей среде кремнезем это необходимое условие для деления диатомей, то, вероятно, в соответствующей водной среде можно вырастить закрепленные на поверхности стекла (один из источников 8Ю2) диатомовые водоросли (одиночные или колонии). Таким образом возможна реализация нового направления — биотехнологической инженерии поверхности, которая является экологически чистой и малозатратной технологией.
Представленная работа посвящена экспериментальному подтверждению возможности био-
Средняя плотность закрепления на поверхности стекла створок различных культур диатомей в различные периоды времени
Время
Плотность (клеток/мм2) закрепления на поверхности стекла створок различных культур диатомей
выдержки стекла, недели Achnanthidium sp. Gomphonema parvulum Navicula sp. Nitzschia palea Nitzschia sp. Sellaphora minima
2 800 (n = 2) 39 (n = 3) 998 (n = 2) 2064 (n = 4) 503 (n = 2) 487 (n = 6)
6 151 (n = 14) 43 (n = 13) 16 (n = 8) 1350 (n = 9) 273 (n = 8) 486 (n = 5)
U3 1 13.5 0 8. 4 15
U^ 3 6 1 7 1 5
инженерного формирования микро- и наноструктуры поверхности стекла с помощью диатомовых водорослей и исследованию морфологии и некоторых характеристик поверхности стекла.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В эксперименте использовали культуры Ach-nanthidium sp., Craticula ef. minusculoides, Diadesmis confervacea, Gomphonema parvulum, Navicula sp., Nitzschiapalea, Nitzschia sp., Sellaphora minima, полученные из коллекции кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Диатомовые водоросли выращивали в плотно закрытых колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл питательной среды Чу-10 [15], которую предварительно стерилизовали в автоклаве при 112°С в течение 30 мин.
Инокуляты вносили в колбы с питательной средой и инкубировали в течение 14 суток при 20°С и освещенности 3000 люкс. Пробы водорослей отбирали каждые 5 суток для микроскопического контроля. Через 14 суток инкубирования этих культур в каждую колбу помещали по 3 стеклянные пластины размером 20 х 20 мм и продолжали инкубировать в тех же условиях.
Через 2 (первая выборка) и 6 (вторая выборка) недель извлекали по одной пластине, которые промывали, высушивали и удаляли органические продукты термообработкой (скорость нагрева 10°С/мин, выдержка 0.5 ч при температуре 500°С, инерционное охлаждение в закрытой печи). Микроскопирование полученных образцов и подсчет плотности закрепленных на поверхности стекла клеток проводили на оптическом микроскопе при увеличении х300 и х500. Проверку гипотезы о значимом различии выборок выполняли, как и в работе [16], методом непараметрической статистики с помощью критерия Манна— Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе эксперимента было установлено, что диатомеи Craticula ef. minusculoides, Diadesmis con-
fervacea в глубинной культуре растут медленно и клетки практически не закрепляются на стенках колбы. У диатомеи Navicula sp. отмечен интенсивный рост, клетки прикрепляются к стенкам колбы, но при встряхивании образуют конгломерат в виде пленки, которая оседает на дно колбы. Культуры Nitzschia palea, Nitzschia sp. также активно размножаются и прикрепляются к стенкам колбы, но при встряхивании образуют конгломераты в виде комочков, оседающих на дно. Культуры Sellaphora minima, Achnanthidium sp. и Gomphonema parvulum интенсивно размножаются, клетки прочно прикрепляются к стенкам и дну колбы, при встряхивании остаются прикрепленными. Дальнейшие исследования возможности формирования микро- и наноструктуры поверхности стекла проводили с Achnanthidium sp., Gomphonema parvulum, Navicula sp., Nitzschia palea, Nitzschia sp., Sellaphora minima.
Вид культуры в значительной степени определяет заселенность поверхности стекла, которая уменьшается в ряду Nitzschia palea > Navicula sp. > Achnanthidium sp. > Nitzschia sp. > Sellaphora minima > > Gomphonema parvulum (таблица, время выдержки стекла 2 недели).
На рис. 1 в качестве примера показана поверхность стекла с закрепленными створками диатомовых водорослей Achnanthidium sp. и Nitzschia sp. после 6 недель инкубирования в питательной среде.
Из данных табл. 1 следует, что в условиях эксперимента наиболее активный рост и заселение поверхности стекла диатомеями наблюдалось в период до двух недель. При дальнейшем инкубировании заселенность поверхности оставалась практически постоянной (экспериментальный критерий Манна—Уитни U3 больше критического Ugp для Gomphonema parvulum, Nitzschia palea, Nitzschia sp., Sellaphora minima) или снижалась (U3 < U^ для Achnanthidium sp. и Navicula sp.). В последнем случае на микрофотографиях образцов отмечалось наличие разрушенных створок диатомей, вероятно, вследствие их повторного использования растущими микроорганизмами. Для образцов с Nitzschia palea отмечалось наличие участков поверхности стекла с высокой плотностью заселен-
Рис. 1. Участки поверхности стекла с закрепленными створками диатомовых водорослей ЛскпапШШит sp. (а) и Ыи®-сМа sp. (б) после 6 недель инкубирования в питательной среде.
Рис. 2. Участок поверхности стекла с высокой плотностью закрепленных створок диатомовых водорослей Nitzschia palea в виде линейной структуры после 6 недель инкубирования в питательной среде.
X. '"V • V4 4 ^ r--< \ 9
• м
100 мкм 1 0 мк
ности в виде линейных структур на поверхности (рис. 2). Однако роль факторов, определяющих равномерность и величину плотности закрепления створок диатомей, пока не ясна и требует дальнейших исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе экспериментально подтверждена возможность биоинженерного формирования микро- и наноструктуры поверхности стекла с помощью диатомовых водорослей. В дальнейшем необходимо исследовать поведение диатомей в стрессовых ситуациях (например, изменяя концентрацию кремния, освещенность), изучить условия, определяющие равномерность и величину плотности закрепленных створок, направления роста колоний диатомей и разработать научные основы получения высокочистой кварцевой микро- и наноструктурированной поверхности.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (грант № 11G34.31.0027).
ОБОЗНАЧЕНИЯ
n — объем выборки;
U — статистический критерий Манна—Уитни. ИНДЕКСЫ
кр — критическое значение критерия Манна— Уитни;
э — экспериментальное значение критерия Манна—Уитни.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hamm C.H., Merkel R, Springer O. et al. Architecture and material properties of diatom shells provide effective mechanical protection // Nature. 2003. V. 421. №2. P. 841.
22
САРКИСОВ и др.
2. Грачёв М.А., Анненков В.В., Верещагин А.Л. Способ получения кварцевого
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.