научная статья по теме ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ИНОКУЛЯЦИИ ЯЧМЕНЯ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ СВИНЦОМ И КАДМИЕМ Биология

Текст научной статьи на тему «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ИНОКУЛЯЦИИ ЯЧМЕНЯ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ СВИНЦОМ И КАДМИЕМ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 118-125

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 631.46:579.62 +633.16

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ИНОКУЛЯЦИИ ЯЧМЕНЯ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ СВИНЦОМ И КАДМИЕМ

© 2004 г. А. А. Белимов*1, А. М. Кунакова*, В. И. Сафронова*, В. В. Степанок**, Л. Ю. Юдкин**, Ю. В. Алексеев***, А. П. Кожемяков*

*Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, Пушкин **Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственного использования

мелиорированных земель, п/о Эммаус, Тверь ***Агрофизический научно-исследовательский институт, Пушкин Поступила в редакцию 20.03.02 г.

В лабораторных условиях ассоциативные ризобактерии А20зр1гШит Нро/егит 137, АпНгоЬааег шуъо-гет 7, AgroЬacterium гайюЬааег 10 и ПауоЬааегшт эр. Ь30 обладали сравнительно высокой устойчивостью к токсичному действию свинца (РЬ) и кадмия (Cd), за исключением чувствительного к Cd штамма Ь30. При интродукции на семена, устойчивые штаммы активно колонизировали корни ячменя в присутствии токсичных для растений концентраций РЬ и Cd в почве. Бактеризация семян положительно влияла на рост и улучшала потребление питательных элементов растениями из обогащенной РЬ и Cd почвы в условиях вегетационного и полевых опытов. В то же время содержание РЬ и Cd в зерне ячменя не повышалось, а в отдельных случаях снижалось. Результаты исследований показали, что интродукция ассоциативных бактерий способствует снижению токсичного действия тяжелых металлов на растения.

Ключевые слова: ассоциативные бактерии, кадмий, ризосфера, свинец, ячмень.

Загрязнение почвы тяжелыми металлами (ТМ), такими как свинец (Pb) и кадмий (Cd), приводит к повышению содержания этих токсичных элементов в сельскохозяйственной продукции, снижает урожайность и содержание питательных элементов в растениях [1, 2]. Накопление ТМ в почве снижает видовое разнообразие почвенной микрофлоры и ингибирует многие микробиологические процессы [3]. В то же время, микроорганизмы могут обладать высокой устойчивостью к ТМ и влиять на их подвижность в почве посредством изменения рН и редокспотенциала среды, продуцирования хелатов и сидерофоров, биосорбции и биоаккумуляции [4].

Результаты пока немногочисленных исследований указывают на то, что ризосферные бактерии могут играть существенную роль в устойчивости растений к стрессу, вызванному токсичностью ТМ. Растения пшеницы накапливали меньше Cd [5] и Pb [6] при выращивании на нестерильной почве по сравнению со стерильной. Инокуляция рапса и горчицы сарептской ризобактериями повышала устойчивость растений к никелю (Ni), Pb, цинку (Zn) и Cd [7, 8]. Изученные в данной работе штаммы стимулировали рост корней и повышали содержание питательных элементов в пророст-

1 Автор для переписки (E-mail: belimov@rambler.ru).

ках ячменя в условиях водной культуры в присутствии Cd [9].

Целью настоящей работы являлось изучение устойчивости ассоциативных ризобактерий к ТМ, и оценка влияния бактеризации на рост и элементный состав растений ячменя в условиях загрязнения почвы РЬ и Cd.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлись производственные штаммы ассоциативных ризобактерий AzospiгШum Нро/егит 137, А^НгоЬа^ег тузогет 7, AgгoЬacteгium гаёюЬа^ег 10 и Г1ауоЬа^егшт ер. Ь30, полученные от Л.Ф. Васюк и В.Ф. Павловой, ВНИИСХМ. Устойчивость бактерий к ТМ оценивали по их росту путем культивирования в течение 5 сут при 28°С на агаризованной питательной среде РТМ (г/л: глюкоза - 1; сахароза - 1; пептон - 1; дрожжевой экстракт - 1; КН4К03 - 0.5; MgS04 - 0.2; Каа - 0.1; Caа2 - 0.02; Реа3 - 0.01; рН 6.8), обогащенной солями РЬ^Н^^, CdCl2, €иа2, №а2 и 7иа2 в концентрацях от 0 до 2000 |М. Для определения биоиммобилизации Cd бактерии выращивали (4-кратная повторность) в течение 4 сут при 28°С в жидкой среде РТМ, содержащей 50 мкМ CdCl2. Суспензии бактерий центрифугировали (10000 g; 15 мин), биомассу отмывали

Таблица 1. Устойчивость ассоциативных бактерий к тяжелым металлам при культивировании на агаризованной питательной среде

Штамм Концентрация металлов в питательной среде, мкМ

Pb Cd Cu Ni Zn

A. lipoferum 137 200/700 30/350 50/150 150/400 400/1000

A. mysorens 7 400/1000 50/600 200/700 50/250 500/1500

A. radiobacter 10 200/800 60/500 100/450 150/500 150/800

Flavobacterium sp. L30 100/500 2/10 70/300 25/200 400/1000

Примечание. Слева указаны минимальные концентрации металлов, при которых наблюдалось ингибирование роста бактерий; справа указаны минимальные летальные концентрации металлов, при которых рост отсутствовал.

двукратно дистиллированной водой, ресуспензи-ровали в воде и измеряли оптическую плотность суспензий на фотоэлектроколориметре КФК-2УХЛ при 540 нм. Аликвоты супернатанта и суспензий бактерий упаривали при 95°С до полного удаления воды. Осадок растворяли в концентрированной HNO3, повторно упаривали и растворяли в 10% HNO3. Содержание Cd в образцах определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре "Perkin Elmer" 403 с электротермической атомизацией (Grafite Cell HGA-74). Коэффициенты распределения (КР) кадмия между биомассой бактерий и питательной средой рассчитывали как соотношение концентраций (мкг Cd/мг) в сухой биомассе и супернатанте.

В вегетационном опыте ячмень сорта Целин-ный-5 выращивали в сосудах (6-ти кратная повтор-ность, 6 растений в сосуде), содержащих 2.5 кг дерново-подзолистой слабоокультуренной почвы (мг/кг: гумус - 13000; общий N - 1500; подвижный P - 400; подвижный K - 190; общий Pb - 17; общий Cd - 0.8; рН 6.0). В почву вносили удобрения (мг/кг: NH4NO3 - 300; K2HPO4 - 250; KCl - 125; MgSO4 - 60; H3BO3 - 3; MnSO4 - 3; ZnSO4 - 3; Na2MoO4 - 1.5) и обогащали свинцом (100 и 500 мг Pb/кг в форме Pb(C2H3O2)2) или кадмием (30 и 75 мг Cd/кг в форме Cd(NO3)2). После внесения удобрений и солей ТМ почву увлажняли и выдерживали в сосудах в течение 10 сут. Семена ячменя стерилизовали смесью перекиси водорода и этилового спирта (1 : 1) в течение 3 мин, сеяли в почву и ино-кулировали водными суспензиями бактерий в количестве 107 кл./семя. Для инокуляции использовали устойчивые к рифампицину (40 мг/л) и стрептомицину (500 мг/л) мутанты штаммов [10]. Растения выращивали в течение 40 суток до фазы колошения. Выживаемость бактерий в ризоплане определяли методом интродукции антибиотико-устойчивых вариантов [10].

Полевые опыты с ячменем сорта Абава проводили во ВНИИСХМЗ (г. Тверь) в 1994 г. (эксперимент 1) и 1995 г. (эксперимент 2) на делянках площадью 1 х 1.6 м2 в 4-кратной повторности. Дерново-подзолистую легкосуглинистую почву

опытных участков (эксперимент 1/эксперимент 2, мк/кг: гумус - 18000/22000; нитратный N - 14/12; аммонийный N - 29/23; подвижный P - 130/110; подвижный K - 192/195; рН - 5.1/5.8) удобряли (N30P80K90) и обогащали свинцом (100 и 300 мг Pb/кг в форме Pb(C2H3O2)2) или кадмием (5 и 15 мг Cd/кг в форме Cd(NO3)2) в расчете на 1 кг пахотного горизонта (0-20 см) почвы путем внесения растворов солей за 40 дней до посева семян. Семена обрабатывали коммерческими биопрепаратами азоризин (A. lipoferum 137), мизорин (A. myso-rens 7), агрофил (A. radiobacter 10) и флавобакте-рин (Flavobacterium sp. L30) в количестве 1.5 г/кг семян [11]. Количество бактерий в биопрепаратах, изготовленных во ВНИИСХМ на у-стерили-зованном торфе, составляло не менее 109 клеток в 1 г торфа. Содержание P, K, S, Ca, Pb и Cd в растениях определяли методом рентгено-флуорес-центного анализа с использованием детектора БДРК-1425 и многоканального амплитудного анализатора АИ1029-95.

Статистическую обработку данных осуществляли стандартным методом расчета стандартных отклонений и методом двухфакторного дисперсионного анализа с помощью программы STATIS-TICA V-5 (StatSoft, Inc. [1995], USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При культивировании бактерий в лабораторных условиях установлено, что изучаемые штаммы, за исключением Cd-чувствительного Flavobacterium sp. L30, способны расти в присутствии высоких концентраций Pb, Cd, Cu, Ni и Zn в среде (табл. 1) и могут быть отнесены к почвенным микроорганизмам, обладающим сравнительно высокой устойчивостью к тяжелым металлам [12, 13]. Штаммы A. mysorens 7 и A. radiobacter 10 обладали максимальной устойчивостью к Cd и Pb.

В вегетационном опыте отрицательное действие Pb на выживаемость A. lipoferum 137 и Flavobacterium sp. L30 в ризоплане проявилось в основном на 25-е и 40-е сут (рис. 1). Внесение Cd снижало выживаемость этих штаммов на корнях

6 5 4 3 8.5 7.5 6.5 5.5

A. lipoferum 137

Л

I

4

A. mysorens 7

ñ^ífi

ft

10

25

40

Сутки после инокуляции

6.5 5.5 4.5 3.5 8 7 6 5

Flavobacterium sp. L30 * ib

ͱ1

f

A. radiobacter 10

fl

rSfil

■b

ffl

rH

10 25 40

Сутки после инокуляции

Рис. 1. Численность интродуцированных штаммов ассоциативных бактерий в ризоплане ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием (вегетационный опыт). Варианты опыта: а - незагрязненная почва; б - внесено 100 мг РЬ/кг; в - внесено 500 мг РЬ/кг; г - внесено 30 мг Cd/кг; д - внесено 75 мг Cd/кг. Названия штаммов указаны на рисунке. Вертикальные отрезки обозначают стандартное отклонение.

д

д

д

д

а

а

а

д

д

д

д

д

д

а

а

в начале вегетации растений. В дальнейшем A. lipoferum 137 адаптировался к неблагоприятным условиям, а Flavobacterium sp. L30 элиминировался из ризопланы. Колонизация корней более устойчивыми штаммами A. mysorens 7 и A. radiobacter 10 не ухудшалась, а в некоторых случаях даже улучшалась в присутствии Pb и Cd. Возможно, это связано с ослаблением конкурентных и антагонистических взаимодействий устойчивых интродуцентов с аборигенными ризосферными микроорганизмами, активность которых может подавляться в присутствии Pb и Cd. Ранее нами было показано, что численность устойчивого к рифам-пицину мутанта A. lipoferum 137, в ризоплане ячменя повышалась при ингибировании активности аборигенной микрофлоры рифампицином [14].

В вегетационном опыте биомасса растений снижалась, а содержание Pb и Cd в растениях существенно повышалось при обогащении почвы этими металлами (табл. 2). Внесение Pb снижало содержание в растениях S и Ca, а внесение Cd снижа

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком