ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2010, том 52, № 10, с. 1768-1779
— БИОПОЛИМЕРЫ
УДК 541.64:547.963
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОСПЕЦИФИЧНЫХ РЕАКЦИЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ НАНОМЕХАНИЧЕСКИХ КАНТИЛЕВЕРНЫХ СИСТЕМ1
© 2010 г. П. В. Горелкин*, ****, Г. А. Киселев**, ****, Д. С. Мухин*, ****, Т. S. Kim***, S. K. Kim***, S. M. Lee***, И. В. Яминский*, ****
*Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова. Химический факультет
119991 Москва, Ленинские горы **Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН
119991 Москва, Ленинский пр., 31 ***Korea Institute of Science and Technology 39-1 Hawolgok-dong, Seongbuk-gu, Seoul 136-791, South Korea ****Общество с ограниченной ответственностью "Академия биосенсоров" 119311 Москва, ул. Строителей, 4-5-47 Поступила в редакцию 11.12.2009 г. Принята в печать 15.04.2010 г.
Исследование наномеханических кантилеверных систем — одно из приоритетных направлений развития в нанотехнологиях. В настоящей работе изучены принципиально новые пути создания биосенсоров на основе нанокантилеверных датчиков, впервые было рассмотрено влияние ориентации рецепторных молекул иммуноглобулина в сенсорном слое на формирование латерального напряжения при комплементарном связывании, разработаны уникальные методики создания селективных рецепторных датчиков на основе кантилеверов. Получены уникальные данные, позволяющие судить о том, что наличие молекул 13-тиотридекан-1,1,2-триол в слое рецепторной ДНК увеличивает латеральное напряжение в процессе гибридизации комплементарных молекул. Сопоставлены теоретические предположения и полученные экспериментальные данные, выявлены основные закономерности влияния формирования латерального напряжения в полимерных слоях на изгиб кан-тилеверного датчика. Охарактеризована природа происхождения латерального напряжения в пленках биополимеров (белки и ДНК) при комплементарном связывании (образовании иммунного комплекса для молекул белков и процессе гибридизации для ДНК).
ВВЕДЕНИЕ
Впервые использование кантилеверов как сенсоров для биологических объектов было продемонстрировано в 1996 г. [1]. Вскоре после этого появилось значительное число работ, посвященных изучению особенностей использования биоспецифических реакций для создания высокочувствительных датчиков на основе наномехани-ческих кантилеверных систем. С 2001 г. ученые, разрабатывающие нанокантилеверные сенсоры, начали уделять повышенное внимание использованию кантилеверных массивов, это позволило одновременно в одной пробе образца следить за несколькими веществами. В работах [2, 3] показа-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (проекты 02.512.11.2279 и 02.513.11.3448), Федерального агентства по образованию (проект П255), NATO (НП CBN.NR.NRSFP 983204) и Корейского института науки и технологии (проект KIST-MSU).
E-mail: gorelkin@genebee.msu.ru (Горелкин Петр Владимирович).
на возможность высокочувствительной параллельной детекции сразу нескольких сиквенсов ДНК (комплементарных с молекулами, иммобилизованными на консоли кантилеверного массива) на фоне большого числа неспецифичных си-квенсов.
В настоящее время установлены некоторые принципиальные эффекты, которые влияют на изгиб кантилеверной консоли, такие как увеличение поверхностного заряда на одной стороне кантилевера, например вследствие образования заряженных хелатных комплексов двухвалентных металлов с молекулами тиолов, привитых к золотой поверхности кантилевера и содержащих специфические гетероциклические группировки [4]. Появление заряда на соседних молекулах в слое, нанесенном на кантилевер, вызывает кулонов-ское взаимодействие между заряженными группировками, которые, в свою очередь, влияют на изгиб кантилевера. Схожий механизм реализуется при гибридизации молекул ДНК на поверхности кантилевера: связывание с поверхностью отрицательно заряженной ДНК увеличивает число
отрицательного заряда на поверхности и снова приводит к сжимающему напряжению [5]. Гибридизация ДНК может также приводить к поверхностному натяжению, вызванному конформаци-онными изменениями в молекулах ДНК, например, когда ДНК превращается из гибкой одноцепочечной, произвольно свернутой, в вытянутую гибридизованную двухцепочечную ДНК. Это вызывает латеральное стерическое напряжение между отдельными молекулами ДНК в слое на поверхности [6].
Существует также множество работ об изучении латерального напряжения, возникающего в белковых слоях. Так, в работе [7] было на примере белка лизоцима показано, как именно влияет на изгиб кантилевера конформационное изменение молекул белка в слое.
В этой работе демонстрируется применение принципа специфического распознавания "ключ—замок", реализованного в белковых молекулах антиген—антитело и молекулах ДНК — комплементарное взаимодействие, для нано-кантилеверной системы "Атомные Весы"™ (ООО "Академия биосенсоров", Россия). Проанализированы особенности, влияющие на формирование латерального напряжения в рецептор-ных слоях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Подготовка реактивов к экспериментам
Реагенты для иммунных реакций — бычий сыво-рочный альбумин (БСА), овальумин, иммуноглобулин козы на пероксидазу хрена (IgG), перокси-даза хрена (ПХ), белок А (" Sigma-Aldrich", США). Во всех экспериментах использовали растворы белков в фосфатном буфере с pH 7.0 с кон-
центрацией 1 и 1 мг/мл, 100, 100 и 3 мкг/мл соответственно.
Для иммобилизации белков на кремниевую поверхность применяли раствор 1-(3-аминопро-пил)силатрана с концентрацией 167 мкмоль/л [В] (методика иммобилизации белков на кремниевую поверхность изложена ниже).
Реагенты для экспериментов с молекулами ДНК — одноцепочечные молекулы ДНК ("Bioneer", Южная Корея). Сенсорная молекула ДНК содержала на 5'-конце тиольную группу и углеродную цепь, включащую в себя восемнадцать атомов углерода, ее сиквенс был 6TTT TTT TTC TTT CCT TCT ATT CGA GAT CTC CTC GA. Сиквенс анализируемой ДНК был DNA TCG AGG AGA TCT CGA ATA GAA GGA AAG. Для экспериментов на наномеханической кантилеверной системе "Атомные Весы"™ делали растворы сенсорной и анализируемой ДНК с концентрацией 10 мкмоль/л в свежеприготовленном буфере Трис-ЭДТА (pH 7.4, 1 M NaCl). В качестве блокатора не прореагировавших адсорбционных центров на золоте использовали раствор 0.5 моль/л 13-тиотридекан-1,1,2-триола (HS-C11H22-EG-OH, "Sigma", США) в этаноле.
Методика "иммобилизация белков на золотую поверхность"
В работе использовали кантилеверы БрС01 производства НИИФП им. Ф.В. Лукина, длина, ширина и толщина которых 350 х 35 х 2 мкм, резонансная частота 10 кГц и силовая константа 0.03 Н/м. Способ прививки белковых макромолекул на поверхность кантилевера описан в работе [7]. Ниже показана поэтапная схема модификации золотой поверхности белковыми макромолекулами
Эту схему использовали для иммобилизации бел- Предварительно подготовленный кантилевер ков на золотую поверхность кантилевера. опускали в 0.01 мольный раствор 4-аминотиофе-
нола ("Sigma", США) в этаноле на 12 ч. Затем кантилевер промывали несколько раз этиловым спиртом и водой и погружали на 2 ч в 5%-ный водный раствор глутарового альдегида. Появившиеся на золотой поверхности альдегидные группы способны образовывать с аминогруппами белка основание Шиффа. Для того, чтобы привить белок только на золотую поверхность и избежать неспецифического связывания белковых макромолекул с кремниевой стороной, обеспечивался контакт только золотой стороны кантилевера с каплей раствора белка, а кремниевая сторона оставалась на воздухе. Иммобилизацию белка на золотую поверхность из капли проводили при постоянной влажности, чтобы избежать испарения воды из капли раствора белка. Не прореагировавшие альдегидные группы блокировали, выдерживая кантилевер в течение одного часа в буферном растворе на основе трис-гидроксиметиламино-метана pH 7.4.
Методика "иммобилизация белков на кремниевую поверхность"
Модификация кремниевой стороны кантилевера белками отличается от аналогичной процедуры с золотой поверхностью только процессом аминирования поверхности (первой стадии модификации). Вместо тиолового монослоя, наносимого на золотую поверхность, при модификации кремния использовали 1-(3-аминопро-пил)силатран, который способен образовывать самоорганизующуюся монослойную пленку на поверхности кремния, как представлено на схеме ниже. Для экспериментов применяли 1-(3-ами-нопропил)силатран, синтезированный по методике, описанной в патенте [8] в лаборатории органического катализа на кафедре химии нефти и органического катализа химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
HO-(CH2)2x /(CH2)^OH
OH OH
I I
O O -Si-O-Si-O—
-CH2 CH2
+ N-CH2-CH2"7Si-CH2-CH2-CH2—NH2-
CH2-CH2
HO-(CH2)24 /CH2)2-OH
N
N
\ /CH2 ^SL
0 O
1 I
—Si—O—Si—O— I I
HO-(CH2)24 /CH^-OH
CH9-CH2-CH2—NH
2
\ CH^CH^CH^NH2
.SiC
O O
—Si-o—Si-o—
O
O
N
\ /CH2
0 O
1 I
—Si-o—Si-o— I I
CH9-CH2-CH2—N
HO-(CH2)2x /(CH2)^OH
O
N
\ .CH-CH-CH-N
0 O
1 I
—Si—O—Si—O—
+ h2n-
Белок
H^(CH2)4 /CH2)2-OH N
\ ch^CH^CH^N
— .Si.
0 O
1 I — Si-O—Si—O—
I I
Белок —N
O
+
Кантилевер с предварительно активированной поверхностью погружали на один час в 167 мкмоль раствор 1-(3-аминопропил)силатрана в воде. Затем процесс иммобилизации белка проводили через глутаровый альдегид аналогично методике, описанной в предыдущем разделе для золотой поверхности [7].
Измерение поверхностного натяжения пленки на поверхности кантилевера
Все измерения, связанные с изменением поверхностного натяжения в рецепторных слоях, выполняли на наномеханической кантилеверной системе "Атомные Весы"™ (ООО "Академия
1 ^2 (а)
хж
Кантилевер
*'V'W
^ / м
Кантилевер
(б)
Рис. 1. Архитектура сенсорного слоя микрокантилеверного сенсора на ПХ при иммобилизации ^О с помощью белка А (а) и при ковалентной иммобилизации антител (б): 1 — белок А, 2 — IgG, 3 — линкер для молекул белков 1-(3-ами-нопропил)силатрана или 4-аминотиофенол + глутаровый альдегид и 4 — БСА.
биосенсоров", Россия). Прибор представляет собой измерительную жидкостную ячейку объемом 200 мкл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.