ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 2, с. 105-109
КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ПРОЛИФЕРАЦИЯ
УДК 576.31.7.611-018.1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА, ВЫРАЩЕННЫХ НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ, ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКВИВАЛЕНТА
__V __1
СОЕДИНИТЕЛЬНОМ ТКАНИ1
© 2004 г. О. С. Роговая, А. В. Васильев, И. В. Киселев, В. В. Терских
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова 119991 Москва, ГПС-1, ул. Вавилова, д. 26 Поступила в редакцию 19.12.02 г. Окончательный вариант получен 19.09.03 г.
Для реконструкции дефектов органов и тканей широко используют живые эквиваленты тканей, в частности, созданные на основе фибробластов и коллагенового геля. Для применения в клинике удобнее использовать фибробласты, выращенные на микроносителях, или такой эквивалент соединительной ткани, когда фибробласты на микроносителях заключены в коллагеновый гель. Задача настоящего исследования - изучение свойств эквивалента соединительной ткани, образованного путем заключения в коллагеновый гель фибробластов, выращенных на микроносителях, с тем, чтобы в дальнейшем его можно было использовать в клинике. По результатам наших исследований, оптимальные сроки использования живого эквивалента ткани составляют 3-4 сут после заключения в гель фибробластов на микроносителях. В это время только начинается контракция, что облегчает манипуляции с гелем.
Ключевые слова: фибробласты, микроносители, коллагеновый гель, живой эквивалент ткани.
Живые эквиваленты тканей широко используют для реконструкции дефектов органов и тканей. В качестве биоматрикса в живых тканевых эквивалентах чаще всего используют коллагеновый гель, который представляет собой наиболее физиологичный субстрат, позволяющий моделировать гистотипический рост фибробластов. Фибробласты контрактируют коллагеновый гель и создают структуру, похожую на соединительную ткань, получившую название "живой эквивалент дермы" (Bell et al., 1979). Позднее Белл и соавторы (Bell et al., 1981) создали живой эквивалент кожи, его основой является коллагеновый гель, заселенный фибробластами, на поверхности которого выращены кератиноциты. Такой эквивалент кожи был успешно использован для закрытия ран у крыс, а затем применен в клинической практике (Bell, Rosenberg, 1990).
Культуры фибробластов человека были использованы для лечения ожогов (Саркиеов и др., 1994), гранулирующих ран и язв (Хрупкин и др., 1998) и урогенитальных свищей (Девятов и др., 1997).
Обычно коллагеновый гель засевают суспензией фибробластов, но возможно также использование фибробластов, выращенных на микроносителях (ФМН). В таком виде фибробласты мож-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 01-04-48312а).
но легко транспортировать и сохранять в криобанках.
Поведение фибробластов человека, заключенных в коллагеновый гель, достаточно хорошо изучено (Руднева и др., 1990). Задача настоящей работы - исследование свойств эквивалента соединительной ткани, образованного путем заключения в коллагеновый гель ФМН.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Выделение коллагена. Коллаген I типа получали из сухожилий хвостов лабораторных крыс весом 200 г. Ампутированные хвосты погружали в 70%-ный этанол на 1-2 ч. Все дальнейшие операции проводили в стерильных условиях. С помощью пинцета и ножниц отделяли сухожилия и помещали их в 0.001%-ный раствор уксусной кислоты. Для приготовления 1 л раствора коллагена использовали сухожилия из 10 хвостов.
Экстракцию коллагена проводили при +4°С в течение 48 ч, после чего раствор центрифугировали при 2500 об/мин (2 ч, +4°С). Затем суперна-тант сливали в стерильную посуду и хранили при +4°С. Массовую долю коллагена в полученном растворе определяли при помощи высушивания до постоянного веса.
Приготовление коллагенового геля. Стерильный 0.34 М раствор КаОИ соединяли с концентрированной (х10) питательной средой 199 в соотно-
Рис. 1. Микроносители и фибробласты в коллагено-
вом геле. Увел.: об. х 4, ок. х 10.
шении 1 : 2 и на каждые 100 мл смеси добавляли 100 мг глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Биолот", Санкт-Петербург) и 9 мл 7.5%-ного раствора бикарбоната натрия. Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена в уксусной кислоте в соотношении 1 : 4, после чего помещали на лед для предотвращения быстрой желатинизации. На этом этапе в смесь вносили суспензию фибробластов или ФМН и разливали в чашки Петри ("Nunc", Дания) диаметром 35 мм с неадгезивной поверхностью.
Подготовка микроносителей. Сухие микроносители цитопол ("Биолот", Санкт-Петербург) диаметром 200-300 мкм промывали три раза раствором Хэнкса, заливали средой Игла и оставляли на 2-3 сут для набухания. Подготовленные таким образом микроносители стерилизовали авто-клавированием и хранили в среде Игла в холодильнике в течение года. Для лучшего прикрепления клеток микроносители перед использованием дополнительно обрабатывали раствором коллагена (концентрация 0.1 мг/мл) в течение 20 мин при температуре +37°С, затем отмывали два раза раствором Хэнкса и один раз средой Игла.
Выделение и культивирование фибробластов. Эмбриональные фибробласты человека получали из 3-5-недельного абортивного материала. Эмбрион несколько раз промывали в растворе Хэнкса с гентамицином (1 ампула на 0.5 л раствора), затем отделяли при помощи пинцета и скальпеля кожно-мышечные лоскуты и измельчали их до размера 1-2 мм. Кусочки промывали раствором PBS и помещали в 0.125%-ный раствор трипсина при 37°С. Через 15-20 мин трипсин ингибиро-вали сывороткой, все интенсивно пипетировали и фильтровали через нейлоновую сеточку. Полученную суспензию центрифугировали (800 об/мин, 5 мин), удаляли супернатант и добавляли среду для культивирования. Фибробласты культивировали в среде Игла с глутамином (0.3 мг/мл) и 10% эмбриональной сыворотки коров в С02-инкуба-
торе при 37°С. Смену среды проводили через каждые 3-4 сут, культуры пассировали при достижении конфлуентного слоя.
Постнатальные фибробласты выделяли из лоскутов кожи, оставшихся после косметических операций, с помощью трипсинизации и культивировали, как описано выше.
Культивирование фибробластов на микроносителях производили в сосудах с силиконизиро-ванной поверхностью в специальной роллерной установке при постоянном перемешивании. Внут-ренюю поверхность стеклянного сосуда трехкратно обрабатывали раствором силикона, сушку и стерилизацию проводили при температуре 120°С в течение 2 ч.
Заранее подготовленные микроносители помещали в сосуды для культивирования и вносили туда суспензию фибробластов из расчета 30 тыс. клеток и 100 мкл микроносителей на 1 мл среды Игла. Клетки и микроносители перемешивали в течение 2 мин для прикрепления. В опытах были использованы культуры эмбриональных фибробластов 5-10 пассажей и культуры постнаталь-ных фибробластов кожи человека 6-8 пассажей.
Измерение степени контракции коллагеново-го геля. Контракцию коллагенового геля рассчитывали, измеряя его диаметр с помощью линейки. Первое измерение диаметра геля, еще не начавшего контрактировать, принимали за 100%. На каждый срок проводили по три измерения.
Определение жизнеспособности клеток культур фибробластов человека в коллагеновом геле с использованием флуорохромов. Для выявления живых клеток использовался краситель ФДА (флуоресцеин диацетат). Продукт его гидролиза -флуоресцеин может накапливаться только в клетках с неповрежденной мембраной, поэтому он служил маркером живых клеток, которые светились зеленым в ультрафиолетовом свете. В качестве маркера мертвых клеток использовали бромистый этидий, который проникал в клетки с поврежденной мембраной и окрашивал их ядра в красный цвет. Маточные растворы (ФДА -1 мг/мл, бромистый этидий - 25 мг/мл) разводили до концентрации 25 мкл в 1 мл PBS. В рабочий раствор погружали гель с клетками, а само окрашивание производили при температуре 37°С в течение 10 мин. После нескольких отмывок гель помещали на предметное стекло в 100 мкл PBS, накрывали покровным стеклом и просматривали под микроскопом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При заключении в трехмерный коллагеновый гель эмбриональные фибробласты уже через 2 ч начинают формировать отростки, а через сутки они приобретают вытянутую форму. В эти сроки
Рис. 2. Эмбриональные фибробласты человека на микроносителях (видно, как клетки переходят с микроносителей в гель). Увел.: а - об. х4, ок. х 10; б -об. х 20, ок. х 10.
начинается процесс контракции геля. В отличие от эмбриональных постнатальные фибробласты контрактируют гель с меньшей скоростью. Мы изучили контракцию геля при внесении в него фибробластов в концентрациях 10, 25, 50, 100 и 150 тыс. клеток в 1 мл. В наших условиях оптимальной для изучения эффекта контракции оказались концентрации фибробластов в пределах от 50 до 100 тыс. клеток в 1 мл. Концентрации клеток в этих пределах были использованы для
Рис. 3 Гель, сконтрактированный эмбриональными фибробластами на микроносителях.
выращивания фибробластов на микроносителях и получения эквивалента соединительной ткани.
Для выращивания на микроносителях были использованы пассированные фибробласты, которые быстро прикрепляются к микроносителям и начинают пролиферировать. Спустя 3 сут большая часть микроносителей оказывается покрытой клетками и их можно заключать в гель.
В наших условиях оптимальная концентрация коллагена для приготовления эквивалента соединительной ткани находилась в пределах 1.0-1.5 мг/мл. В более плотном геле (с концентрацией коллагена выше 2 мг/мл) клетки не мигрировали с микроносителей и погибали в течение 6-8 ч. При меньшей плотности коллагена (0.5 мг/мл) гель был "рыхлым" и сильно контрактировал, что затрудняло изучение образованной структуры и использование для восстановления тканевых дефектов. На рис. 1 видны фибробласты человека, выращенные на коллагеновых микроносителях и заключенные в коллагеновый гель. В течение суток фибробласты начинали мигрировать с микроносителей в коллаге-
Контракция коллагенового геля эмбриональными и постнатальными фибробластами человека*
Фибробласты Время контракции геля, сут
человека 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Эмбриональные 100 89 78 64 45 23 9 7 7 7
Постнатальные 100 91 88 80 77 74
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.