научная статья по теме ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ЦЕКРОПИНА Р1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ Биология

Текст научной статьи на тему «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ЦЕКРОПИНА Р1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ»

ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 8, с. 1061-1066

ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ =

УДК 575.1:582.951.4

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ЦЕКРОПИНА Р1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ

© 2009 г. Н. С. Захарченко, С. В. Пиголева, А. А. Юхманова, Я. И. Бурьянов

Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Пущино 142290 e-mail:buryanov@fibkh.serpukhov.su Поступила в редакцию 04.06.2008 г.

Получены безмаркерные трансгенные растения табака с синтетическим геном антимикробного пептида цекропина P1 (cecP1) под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Для трансформации был использован бинарный вектор pBM, не содержащий селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам для отбора трансгенных растений. Скрининг трансформантов проводили на неселективной среде методами детектирования цекропина Р1 в клетках растений, основанными на анализе антибактериальной активности растительных экстрактов и иммуно-ферментном анализе. Эффективность выявления трансформированных регенерантов двумя использованными методами составляет около 2%. Полученные безмаркерные растения проявляют значительное повышение устойчивости к микробным фитопатогенам - бактерии Erwinia carotovora и грибу Sclerotinia sclerotiorum. Таким образом, ген cecP1 можно использовать одновременно в качестве целевого гена и скринингового маркера. Обсуждается возможность применения гена cecP1 в качестве селективного гена для прямого отбора трансформированных растений.

Селективные маркерные гены широко используются для отбора трансформированных растений. В большинстве случаев для этой цели применяются селективные гены устойчивости к антибиотикам канамицину, гигромицину или гербициду фосфинотрицину [1]. Полученные с помощью селективных маркеров трансгенные растения представляют потенциальную биологическую опасность, связанную с присутствием в их геноме этих генов и с возможностью их неконтролируемого переноса другим растениям и организмам. В то же время имеются предпосылки создания трансгенных растений, лишенных этих недостатков и обладающих повышенной безопасностью по сравнению с существующим поколением трансгенных растений. В настоящее время актуальной задачей является получение растений нового поколения, не содержащих селективных маркерных генов. Имеются различные способы избирательной элиминации маркерных генов из хромосомного или хлоропластного генома после отбора трансгенных растений. К ним относится применение систем гомологичной и сайт-специфической рекомбинации Cre/lox, FLP/FRT или R/Rs, вырезающие маркерные гены у полученных растений [2, 3]. Для получения безмаркерных растений предлагается также котрансформация их отдельными векторами для целевого и маркерного генов с последующим разделением этих генов в процессе полового скрещивания растений [4-8]. Существует метод отбора трансформантов

на основе использования агробактериальных генов синтеза фитогормонов и их последующего удаления с помощью транспозаз мобильных генетических элементов, например транспозона кукурузы Ac [9-11].

Цель настоящей работы - получение трансгенных растений с повышенной устойчивостью к микробным фитопатогенам без применения селективных генов для отбора трансформантов. Для отбора трансформированных растений использован целевой ген антимикробного пептида цекропина Р1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование растений. Семена табака Nicotiana tabacum L. сорта Самсун после поверхностной стерилизации в 1%-ном растворе гипо-хлорита натрия проращивали в культуре in vitro на агаризованной безгормональной среде МС, содержащей 7 г/л агара, 30 г/л сахарозы (рН 5.8) и стандартный набор солей [12]. Растения культивировали при температуре 22-24°C, 16-часовом дне и освещенности 2 клк.

Штаммы фитопатогенов. В работе использовали бактериальный штамм Erwinia carotovora subsp. carotovora В15, полученный из Horticulture Centre (Канада) и штамм фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum, полученный из Всероссийского научно-исследовательского института мас-

личных культур им. B.C. Пустовойта, г. Краснодар.

Плазмидные конструкции. B работе использовали векторную плазмиду pBM, не содержащую селективного гена неомицинфосфотрансфе-разы II (nptII) (см. статью Е.Б. Рукавцовой и со-авт. в этом номере). Синтетический ген цекропина Р1 (cecPl) под промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S) [13, 14] в плазмиде pRT103-cecP1 вырезали с помощью рестриктазы SphI и встраивали в вектор pBM по сайту SphI. Полученную конструкцию переносили в штамм Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (pAL4404) [15] и использовали для трансформации растений табака. Встраивание фрагментов ДНК в плазмидные векторы осуществляли по стандартным методикам [16]. Перенос плазмид в агробактерии осуществляли методом конъюгации [17].

Получение трансгенных растений. Трансформацию растений осуществляли методом инокуляции листовых дисков агробактериями [18]. В качестве эксплантов использовали фрагменты листьев размером 1.0 х 1.0 см, полученные из выращенных in vitro 3-4-недельных растений. Экспланты прекультивировали на среде MC для регенерации побегов, содержащей 1 мг/л 6-бен-зиламинопурина (6-БАП) и 0.1 мг/л нафтилуксус-ной кислоты (НУК), в течение двух суток при 24°С. Затем экспланты помещали в бактериальную суспензию (108 кл/мл) на 30-40 с, подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и размещали на агаризованной среде МС с 1 мг/л БАП и 0.1 мг/л НУК. Через двое суток экспланты отмывали от агробактерий средой МС и переносили на среду для регенерации побегов, дополненную 500 мг/л цефатоксима для полного освобождения эксплантов от агробактерий. Через 4 нед. образовавшиеся на эксплантах побеги использовали для анализа. Эффективность трансформации растений определялась как отношение положительных регенерантов по цекропину Р1 ко всем исследуемым регенерированным проросткам.

Анализ антимикробной активности экстрактов трансформированных растений. Буфер для экстракции белков из растений содержал: 10% глицерина, 40 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 100 мМ NH4Cl, 4 мМ фенилметилсульфонилфто-рид, 10.0 мМ трис-HCl, pH 7.5, 3.0 мг/мл дитио-трейтола, 0.2 мг/мл лейпептина, 0.2 мг/мл ингибитора трипсина, 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [18]. Концентрацию общего белка определяли по методу Бредфорд [19]. Антимикробную активность экстрактов на рост клеток фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora определяли методом радиальной диффузии [20] в 1.5%-ных LB-агаровых блоках 10 мм высоты с

бактериями (108 клеток/мл). Исходные образцы экстрактов растений получали из объединенных приблизительно равных по весу (около 100 мг) листовых эксплантов 50 отдельных растений-реге-нерантов. Лиофильно сконцентрированные экстракты, содержащие около 25 мг общего белка (объем 200 мкл), вносили в лунки диаметром 5 мм, приготовленные в LB-агаре. Агаровые блоки инкубировали 8 ч при 4°С для диффузии экстрактов в агар, затем блоки переносили на 25°С и через 2 дня локализовали стерильные зоны вокруг лунок.

Вестерн-блот-анализ. Белковые экстракты из растений получали, используя экстракционный буфер [18]. Электрофорез проводили в три-циновой системе ДСН-ПААГ, белки переносили на нейлоновую мембрану PDVF (Amersham Pharmacia Biotech, Великобритания) [21]. Иммунофер-ментный анализ цекропина Р1 проводили с помощью полученных к этому синтетическому пептиду кроличьих поликлональных антител и антикроличьих иммуноглобулинов, конъюгированных с перок-сидазой хрена. Синтетический цекропин Р1 был получен методом твердофазного синтеза. Проявку мембраны производили с помощью хемилюминес-центной системы ECL ("Pierce", США).

Выделение ДНК из листьев табака и ПЦР. Для ПЦР-анализа трансгенных растений ДНК выделяли из листьев трехнедельных растений [22]. Листья (около 100 мг) растирали в 2-мл пробирках, добавляли 0.4 мл буфера для экстракции (0.2 М трис-HCl, рН 7.5; 0.25 M NaCl; 25 мM ЭДТА; 0.5% SDS), перемешивали и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Далее экстракты осветляли центрифугированием при 12000 об/мин. ДНК осаждали равным объемом изопропанола и осадок растворяли в 100 мкл буфера ТЕ. Полученную растительную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР-анализе. Для этого были использованы праймеры для гена cecPl: 1) 5'-CGG-GATCCATGGGCTCTTG-3' и 2) 5'-CGAGATCT-CTACTTAGCGCGGC-3'. Реакционная смесь содержала 0.1 мкг плазмидной ДНК pRT103-cec в качестве матрицы, 10 мМ трис-HCl, pH 8.8 (при 25°С), 50мМ KCl, 0.1% тритон Х-100, 1.5 мM MgCl2, 0.2 мМ смеси дНТФ ("USB", США), по 50 пикомолей каждого праймера и 2.5 ед. ДНК-поли-меразы Taq ("Promega", США). Реакцию проводили в объеме 25 мкл при следующих условиях: 94°С -5 мин; 30 циклов: 94°С - 1 мин, 55°С - 30 с, 72°С -30 с, затем 72°С - 7 мин на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 (Perkin Elmer, США). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 6%-ном ПААГ в трис-боратном буфере.

Биотесты на изолированных листьях и целых растениях. Для анализа устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам трехнедельные растения заражали суспензией бактерий Erwinia carotovora и мицелием гриба Sclerotinia sclerotiorum.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве источника гена cecP1 была использована плазмида pRT103-cecP1, содержащая синтетический ген цекропина Р1, структура которого была выведена из 31-членной аминокислотной последовательности зрелой формы цекропина Р1 [13]. Ген cecP1, встроенный под промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты в этой плазмиде, был вырезан вместе с экспрессионной кассетой по сайту Sphl и встроен в безмаркерный вектор рВМ (см. статью Е.Б. Рукавцовой и соавт. в этом номере). Полученную конструкцию переносили в клетки Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (рАЬ4404), которые использовали для трансформации листовых эксплантов табака. На трансформированных листовых эксплантах табака, культивируемых на среде для регенерации, через четыре недели наблюдали появление побегов. Для поиска трансформированных растений брали по одному листовому экспланту у каждого из 50 регенерантов, их объединяли в группы (всего 40 групп) и использовали

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком