ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 297-302
= МЕТОДИКА
УДК 581.1.577.175.14:577.15
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ЦИТОКИНИНОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ
ЦИТОКИНИНОКСИДАЗЫ
© 2004 г. С. Ю. Веселов, М. В. Симонян
Биологический факультет Башкирского государственного университета, Уфа
Поступила в редакцию 04.11.2002 г.
Предложен новый высокочувствительный метод оценки активности цитокининоксидазы на основе использования иммуноферментной тест-системы для определения изопентениладенозина. Активность цитокининоксидазы измеряется с помощью иммуноферментного анализа по разнице между количеством добавляемого к ферменту изопентениладенозина и его количеством в реакционной смеси после инкубации. Специфичность метода продемонстрирована в экспериментах с известными активаторами и ингибиторами фермента с постоянным контролем за образованием других форм цитокининов у 4-дневных проростков кукурузы (Zea mays L.).
Zea mays - цитокининоксидаза - иммуноферментный анализ
Цитокинины - полифункциональные фито-гормоны, оказывающие влияние на самые разнообразные физиологические процессы, протекающие в растениях [1, 2]. Предполагается, что воздействие на рост, развитие и другие функции в ходе жизнедеятельности растения реализуются через изменение концентрации цитокининов. Содержание фитогормона в той или иной части растения определяется его продукцией, транспортом, взаимопревращением активных и неактивных форм, а также его распадом. Изучению накопления, транспорта и метаболизма цитокининов посвящено большое количество работ [1-5]. Однако в вопросе о распаде гормона имеется значительный пробел. В настоящее время признано, что основным ферментом, который катаболизи-рует цитокинины, является цитокининоксидаза (ЕС 1.4.3.6). Цитокининоксидазу относят к группе медь-зависимых аминоксидаз [6-8]. Этот фермент катализирует окислительное отщепление ненасыщенной изопреноидной К6-боковой цепочки от цитокининовых субстратов. Соответственно продуктами реакции являются аденин или аденозин [9] и фрагмент боковой цепи - 3-метил-2-бутеналь [10]. В последнее время появились ра-
Сокращения: ИПА - изопентениладенозин, ИФА - иммуноферментный анализ.
Адрес для корреспонденции: Веселов Станислав Юрьевич. 450074 Уфа, ул. Фрунзе, 32. Башкирский государственный университет, биологический факультет. Факс: 07(3472) 22-68-31; электронная почта: veselov@bsu.bashedu.ru
боты, в которых показано, что цитокининоксидазы из растений Zea mays и Arabidopsis thaliana принадлежат к флавопротеидам [11-13]. По-видимому, возможно существование различных форм цитокининоксидаз или участие в окислении фитогормона нескольких белков - переносчиков электронов, один из которых содержит медь [11].
Существенным тормозом в развитии представлений об участии цитокининоксидазы в регуляции концентрации цитокининов является ограниченная методическая база. На сегодняшний день предложено два подхода для оценки активности фермента. Один из них, основанный на колориметрическом определении продукта окислительной реакции - 3-метил-2-бутеналя [14], обладает низкой чувствительностью. Методы, в которых регистрируют высвобождение радиоактивного аде-нина из фитогормона, содержащего изотоп углерода 14С или водорода 3H [6, 15], малодоступны для большинства лабораторий.
В настоящем исследовании была поставлена задача разработать высокочувствительный и достаточно простой метод определения активности цитокининоксидазы, не требующий использования радиоактивных фитогормонов. В основу этого метода был положен описанный нами ранее принцип оценки активности цитокининоксидазы с помощью иммуноферментного анализа по разнице между количеством добавляемого к ферменту изопентениладенозина и его оставшимся количеством в реакционной смеси после инкубации [16].
Таблица 1. Специфичность тест-системы для определения ИПА
Соединения Перекрестная реактивность, %
Зеатин 0.3
Зеатинрибозид 1.6
№-глюкозид зеатина 0.3
Дигидрозеатин 1.9
Дигидрозеатинрибозид 0.9
Изопентениладенин 63.0
Изопентениладенозин 100
Кинетин 0.9
О-глюкозид зеатина 0
Аденин 0
МЕТОДИКА
Выращивание растений. Семена кукурузы (Zea mays L.) гибрида Краснодарский 1642 обрабатывали 3%-ным раствором перекиси водорода в течение 5 мин, 70%-ным этанолом 1 мин и промывали в дистиллированной воде три раза по 15 мин. Обработанные семена проращивали на водопроводной воде в темноте при 22°С в течение четырех суток.
Определение активности ферментов, катаболи-зирующих изопентениладенозин. Четырехдневные проростки кукурузы отделяли от эндосперма и 1 г гомогенизировали в 2.5 мл холодного (6°С) 0.1 М Трис-НС1-буфера (pH 7.1) или 0.1 М имидазол-HCl-буфера (pH 7.1). Гомогенат центрифугировали при 12000 g в течение 25 мин. Белки из супер-натанта осаждали добавлением равного объема насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугировали при 5000 g в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в первоначально используемом буфере, доводя объем до 1.5 мл. Концентрация белка в полученном препарате составляла 1.8-2.0 мг/мл. 50 мкл препарата добавляли к 50 мкл смеси, содержащей стандарт изопентени-ладенозина (ИПА, 300 нг/мл) и, соответственно, Трис-HCl или имидазол-НС1-буфер в конечной концентрации 0.04 М, а также в ряде опытов 1 мМ CuSO4 и/или 1,3-дифенилмочевину в конечной концентрации 20 мкМ. Для контроля в смесь вместо белкового препарата добавляли 50 мкл соответствующего буфера. Реакционные смеси инкубировали в термостате при 37°С в течение 0.5-6 ч. Реакцию останавливали добавлением 0.2 мл холодного этанола и проводили центрифугирование при 5000 g в течение 10 мин. Содержание ИПА в супернатанте оценивали с помощью им-муноферментного анализа в тест-системе для определения ИПА. Для определения активности ферментов, метаболизирующих ИПА, использо-
вали метод иммуноферментного анализа (ИФА). Активность оценивали по разнице между количеством добавляемого к белковому препарату ИПА и его количеством в смеси после инкубации.
Приготовление конъюгата ИПА с белком и получение антител. Конъюгацию ИПА с оваль-бумином осуществляли с помощью периодата натрия по методу Erlanger и Beiser [17]. Сыворотку к ИПА получали, как описано в работе [18].
Твердофазный иммуноферментный анализ. Для иммуноанализа ИПА использовали вариант, при котором конъюгат белка с гормоном сорбировали на твердой фазе [19] и после взаимодействия твердофазного и свободного антигена с антителами кролика против ИПА реакцию проявляли с помощью антикроличьего пероксидазного конъю-гата [18].
ИФА других цитокининов проводили по той же схеме, но использовали соответствующие конъюгаты гормона с белком и сыворотки.
Определение белка. Количество белка в препаратах ферментов оценивали по Lowry [20].
Экстракция цитокининов. Растительный материал гомогенизировали в жидком азоте и экстрагировали 80%-ным этанолом в соотношении 1 : 10 в течение 14 ч при 4°С. Супернатант отделяли центрифугированием (10 мин, 12000 g) при охлаждении и упаривали до водного остатка.
Материалы и реактивы. В работе использовали ИПА, зеатин, зеатинрибозид, дигидрозеатин, дигидрозеатинрибозид фирмы "Sigma" (США), другие производные цитокининов - фирмы "Apex Organics" (Англия), глютаровый альдегид, мета-периодат натрия, имидазол, 1,3-дифенилмочевину, opmo-фенилдиамин, антивидовой пероксидаз-ный конъюгат - фирмы "Sigma", бычий сывороточный альбумин, овальбумин и Твин-20 - фирмы "Serva" (Германия), адьювант Фрейнда -фирмы "Dynatech" (Германия). Полистироловые планшеты получены от фирмы "Linbro" (Англия) и "Nunc" (Дания). Все остальные реагенты - отечественного производства марки "х.ч." или "ч.".
Все опыты проводили в трех биологических и четырех аналитических повторностях. На рисунках и в таблицах приведены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки активности цитокининоксидазы по количеству деградированного цитокинина прежде всего была подобрана иммуноферментная тест-система для определения ИПА. В табл. 1 представлены результаты исследования специфичности полученной тест-системы. Хорошо прослеживается, что в этой системе такие соединения, как зеатин, дигидрозеатин и их производные, обладают крайне низкой перекрестной реак-
тивностью и совершенно не реактивен аденин. Последнее обстоятельство имеет очень важное значение, поскольку образующийся в процессе работы цитокининоксидазы аденин не должен влиять на результаты определения ИПА. Чувствительность ИФА оказалась очень высокой и составила 200 пкг/мл.
Поскольку в процессе остановки ферментативной реакции с участием цитокининоксидазы и отделения фитогормона от белка использовали этанол в конечной концентрации 61%, образцы перед ИФА необходимо было упаривать до водного остатка. Эту процедуру использовали в связи с тем, что в ходе ИФА этанол мог помешать взаимодействию антигена со специфическими антителами, что в результате могло привести к неправильной оценке цитокининоксидазной активности. Однако упаривание значительно увеличивало трудоемкость метода. Учитывая высокую чувствительность анализа, была предпринята попытка исследовать при ИФА непосредственно спиртсодержащие образцы, внося небольшие аликвоты (10 мкл) исследуемого материала в лунки с общим объемом реакционной смеси 0.2 мл. При этом конечная концентрация спирта составила 3%. Для выравнивания условий проведения реакции в лунки со стандартом ИПА также вносили этанол в аналогичной концентрации. Однако такой подход приводил к значительному снижению чувствительности анализа.
Для повышения чувствительности ИФА в присутствии спирта этап взаимодействия антигена с антителами было решено проводить в течение 16 ч (ночь) при 4°С. Такая продолжительная инкубация значительно повышала чувствительность ИФА по сравнению с обычной процедурой взаимодействия антигена с антителами в течение 1 ч при 37°С. Причем чувствительность ИФА при наличии спирта в образце при ночной инкубации даже несколько превышала чувствительность ИФА с образцами без спирта при 1 ч инкубации (рис. 1).
Другим препятствием для достоверного определения активности цитокининоксидазы могли явиться эндогенные цитокинины, при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.