НЕИРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 1, с. 65-68
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.1:616-001.8:518.5
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАТЕМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОЦЕНКИ КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В МОЗГЕ ЖИВОТНЫХ
В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ
© 2007 г. А. Н. Мошкова1*, Е. М. Хватова2, И. А. Русакова1
1 Государственный технический университет, Н. Новгород 2 Государственная медицинская академия, Н. Новгород
Использован математический метод анализа кинетической зависимости скорости окислительного фосфорилирования (АДФД) от концентрации экзогенного [АДФ] в митохондриях мозга. Построена математическая модель, аппроксимирующая эту зависимость в разных условиях жизнедеятельности организма. Предоставляется возможность разработать аналитический способ расчета характеристик реакции окислительного фосфорилирования и прогнозировать кинетические свойства окислительного синтеза АТФ в митохондриях мозга при гипоксическом воздействии на организм животного.
Ключевые слова: аденазиндифосфат, скорость окислительного фосфорилирования, константа Михаэлиса-Ментен, гипоксия, мозг.
Известно, что изменение скорости ферментативной реакции S + E о SE —► P + E по мере изменения концентрации субстрата может представлять собой тип гиперболической зависимости, которая получила определение как классический тип кинетики развития ферментативной реакции. На основании кинетических уравнений таких реакций рассчитываются кинетические константы: максимальная скорость (Vmax) и константа Михаэлиса-Ментен (km). Можно гиперболический тип кинетических уравнений преобразовать в линейную форму, которая вместо гиперболы дает графически прямую линию. Однако в обоих случаях определять характеристики ферментативной реакции приходится графически. Существует и другой метод расчета km и Vmax по уравнению Миха-
Vmax [ S ]
элиса-Ментен v = --— - метод итерации, ко-
km + [ S ]
торый не позволяет находить эти константы одновременно по экспериментальным показателям скорости ферментативной реакции.
В данной работе установлен вид зависимости скорости окислительного фосфорилирования (АДФ/t) от концентрации экзогенного [АДФ] в митохондриях мозга животных в условиях гипоксии разной степени тяжести и продолжительности. Использована дробно-линейная функция
* Адресат для корреспонденции: 603005, Н. Новгород, ул. Минина, д. 24; тел. (8312)36-63-93; факс: 8312-36-23-11; e-mail: ria_nn@mail.ru
у = -, где х - концентрация [АДФ], у - по-
а0 х + аг
казатель (АДФД), аппроксимирующая эту зависимость в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. По предлагаемой формуле можно рассчитать максимальную скорость реакции фосфорилирования АДФ и константу Михаэлиса-Ментен.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В эксперименте использовали белых беспородных крыс весом 150-200 г, содержащихся на общевиварном режиме. Общее количество животных (~100) было поделено на контрольную и опытную группы. Контрольную группу составляли интактные животные. Исследование интакт-ных животных проводили одновременно с опытными на протяжении всей экспериментальной работы. Экспериментальной моделью служила гипобарическая гипоксия, создаваемая разрежением атмосферного давления в барокамере проточного типа. Опытные животные находились в атмосфере с разной степенью дефицита кислорода и разной экспозицией: 217 мм рт. ст. - 60 и 10 мин; 170.5 мм рт. ст. - до 10 мин. Митохондрии из головного мозга выделяли методом дифференциального центрифугирования. Концентрацию митохондриального белка определяли по Lowry е! а1. [1]). Потребление кислорода митохондри-альной суспензией регистрировали полярографическим методом. Все эксперименты проводили при комнатной температуре (20°С).
Таблица 1. Значение АДФ/г в мозге животных в условиях гипоксии с разной экспозицией
Условия Показатель АДФ/t мкмоль/мг белка/сек
эксперимента 40 60 90 150 300
Контроль 217 мм рт. ст. 10 мин 217 мм рт. ст. 60 мин 170 мм рт. ст. до 10 мин 89.6 ± 3.62 (9) *75.5 ± 3.9 (9) P < 0.05 *111.9 ± 8.9 (9) P < 0.05 *70.4 ± 4.5 (9) P < 0.05 106.6 ± 3.62 (9) *95.69 ± 3.8 (8) P < 0.05 *126.0 ± 7.89 (8) P < 0.05 *89.8 ± 3.3 (9) P < 0.05 120.25 ± 5.8 (8) 119.8 ± 6.0 (9) 131.6 ± 8.8 (9) 118.8 ± 4.5 (9) 139.3 ± 6.7 (9) 147.4 ± 6.7 (9) 139.3 ± 9.8 (9) 145.1 ± 4.1 (10) 163.5 ± 9.2 (9) 178.4 ± 12.1 (8) 159.8 ± 11.3 (8) 169.4 ± 6.1 (10)
* Достоверность изменений АДФД по сравнению с контролем, р - уровень значимости отличий.
Среда инкубации митохондрий имела следующий состав: сахароза 250 мкмоль; KH2PO4 20 мкмоль; ЭДТА 0.5 мкмоль; pH 7.4.
В качестве субстрата окисления использовался глутамат калия (15 мкмоль). Объем добавленной митохондриальной суспензии в каждую пробу составлял 0.06 мл и содержал 22.0-23.0 мг белка. Конечный объем пробы 1 мл. Добавка в инкубационную среду митохондриальной фракции проводилась сразу же после ее выделения. Регистрацию дыхания осуществляли на поларогра-фе LP-60A. Добавку АДФ осуществляли с помощью микрошприца до конечной концентрации в ячейке 40, 60, 90, 150, 300 мкмоль. Регистрировался переход состояния 3 - "активное состояние" и последующий переход в 4-е состояние - "состояние покоя". В качестве показателя скорости фос-форилирования АДФ использовался коэффициент АДФ/t - фосфорилирование АДФ в единицу времени (1 с). Скорость утилизации АДФ рассчитывалась в мкмолях АДФ/мг • белка/с. Все результаты опытов были обработаны методом вариационной статистики [2, 3]. Анализ и расчет коэффициента Михаэлиса-Ментена и максимальной скорости фосфорилирования АДФ проводились с помощью программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализируя значение скорости фосфорилирования АДФ в разных условиях опыта, можно отметить следующее. При кратковременной гипоксии (до 10 мин), создаваемой разной степенью разрежения атмосферного давления 217 и 170.5 мм рт. ст., наблюдается достоверное снижение показателя АДФ/t по сравнению с нормой при малых концентрациях добавленного АДФ (40, 60 мкмоль). Часовая экспозиция при атмосферном давлении 217 мм рт. ст. дает достоверное повышение АДФ/t по сравнению с группой интактных животных при тех же экзогенных концентрациях АДФ. По мере увеличения добавленного АДФ
(90, 150, 300 мкмоль) показатель АДФ/t изменяется незначительно и стремится к величине показателя нормы во всех экспериментальных группах животных (атм. давл. 217 мм рт. ст. от 10 до 60 мин, 170.5 мм рт. ст. до 10 мин). Результаты эксперимента показывают, что скорость фосфорилирования АДФ есть зависимая переменная величина от концентрации экзогенного [АДФ] и состояния организма (табл. 1). Во всех исследованных условиях существенных изменений Vmax не наблюдается. Колебания максимальной скорости реакции на ±20; ±30%. В то время изменение km в короткие сроки пребывания животных в состоянии гипоксии растет на 110-140%, а при продолжительной гипоксии 60 мин на 45%, что указывает на изменение сродства фермента к субстрату (табл. 2).
Использовалась графическая иллюстрация зависимости экспериментальных значений АДФ/t от концентрации экзогенного [АДФ]. Для этого в системе координат XOY строились точки (xt, y), где x, - значение АДФ/t, y t - концентрация экзогенного [АДФ] для каждого проведенного эксперимента. Эти точки объединялись кривой, которая указывала на вид кинетики реакции. Он оказался гиперболическим. Существование гиперболической формы зависимости скорости фосфорилирования от концентрации добавленного АДФ отмечали и другие исследователи. Так, Kuster V., Bohnensak R., Kunz W. [4], изучая регуляцию окислительного фосфорилирования внемитохондри-альным отношением АТФ/АДФ на инкубированных митохондриях печени крыс в среде, содержащей сукцинат, АТФ и глюкозу, считали, что изменение скорости фосфорилирования в митохондриях описывается гиперболической зависимостью от внемитохондриальной концентрации АДФ.
Чтобы описать аналитически зависимость между показателем АДФ/t и концентрацией экзогенного [АДФ], выбирались определенные функции, аппроксимирующие соответствующий тип
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАТЕМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
67
Таблица 2. Значения показателей процесса фосфорилирования АДФ в мозге животных в условиях гипоксии разной тяжести и продолжительности
Условия эксперимента Максимальная скорость фосфорилирования (Ушах), рассчитанная Коэффициент Михаэлиса-Ментен (Кт), рассчитанный
по графику Лайнуивера-Берка аналитически по графику Лайнуивера-Берка аналитически
Контроль 181.18 184.7 40 40.99
217 мм рт. ст. 10 мин 222.2 223.3 83.8 78.2
217 мм рт. ст. 60 мин 161.3 161.1 17.9 17.3
170 мм рт. ст. до 10 мин 222.2 226.7 90.7 87.98
кинетики реакции. В нашем случае при гиперболическом типе развития реакции окислительного фосфорилирования рассматривалась дробно-линейная функция у = —Х+— , аппроксимирующая
зависимость между выбранными показателями: х - концентрация [АДФ], у - показатель (АДФ/!). После преобразования этой функции к линейному виду у' = а0 + ахх\ где у' = - , х' = - , коэффици-
ух
енты а0, а1 находили методом наименьших квадратов (табл. 3). Анализируя зависимость у =
= —х— между выбранными показателями,
а0 х + а1
установлено, что вид функции не менялся во всех экспериментальных условиях (интактные животные в условиях гипоксии), что свидетельствует о стабильном состоянии кинетики реакции, аппроксимирующейся дробно-линейной функцией. На основании этого можно предположить, что гиперболическая форма зависимости между скоростью окислительного фосфорилирования и концентрацией экзогенного АДФ сохраняется независимо от физиологического состояния организма. Изменение физиологического состояния организма отражается лишь в величине коэффициентов а0, а1, которые принимают определенные числовые значения в каждом отдельном эксперименте. Попытка спрогнозировать значение показателя АДФ/!, когда добавленная концентрация экзогенного АДФ задавалась выше экспериментальной, показала, что при насыщающих концентрациях [АДФ](х) показатель АДФ/!(у) мало изменяется, т.е. стремится к постоянной величине. В качестве примера указываем значение показателя АДФ/!, найденное аналитически при экзогенной концентрации [АДФ] в 500, 600, 1000 мкмоль у интакт-ных животных: 171.2, 173.4,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.