РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2011, том 51, № 6, с. 715-720
-- УФ-ОБЛУЧЕНИЕ =
УДК [57+61]::539.1.04:614.875:57.088:599.323.4
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛАЗЕРНОЙ ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШИ, ОБЛУЧЕННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ Б-СВЕТОМ
© 2011 г. М. В. Загубиженко1, *, А. И. Юсипович1, С. К. Пирутин1, 2, В. Л. Минаев3, Ю. Б. Кудряшов1
1Кафедра биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 3Всероссийский научно-исследовательский институт оптико-физических измерений (ФГУП "ВНИИОФИ"), Москва
С помощью метода лазерной интерференционной микроскопии исследовали зависимое от дозы излучения повреждение мембран перитонеальных мышиных макрофагов, облученных ультрафиолетовым диапазона Б (УФ-Б) светом. Лазерная интерференционная микроскопия (ЛИМ) — метод, который позволяет оценить морфологические и функциональные параметры клетки без введения в нее красителей и прочих веществ, которые могут повлиять на состояние клетки. Это значительно сокращает и ускоряет процедуру подсчета поврежденных клеток по сравнению с методами, в которых применяются красители. В качестве индикатора повреждений использовали измеряемую методом ЛИМ величину оптической разности хода (ОРХ), пропорциональную толщине объекта и разнице показателей светопреломления объекта и окружающей среды. Проведено сравнение методов ЛИМ и микрофлуоремитрического при исследовании состояния мембран облученных макрофагов.
Лазерная интерференционная микроскопия (ЛИМ), макрофаги, УФ-Б.
Использование различных красителей во многих случаях —это необходимое условие проведения экспериментов. Однако использование красителей может привести к дополнительному нежелательному воздействию на исследуемые биологические объекты. Так, например, флуоресцентные зонды стимулируют фотозависимое разрушение клетки [1]. Проблема особенно актуальна в случае оценки действия на клетки, в частности УФ-света. Воздействие света усиливается наличием красителя, что значительно сокращает время адекватного наблюдения вызванного эффекта из-за преждевременных повреждений клетки и требует дополнительных экспериментальных процедур для учета указанного эффекта.
Таким образом, для оценки состояния живой клетки в условиях in vivo и in vitro необходимо использовать не повреждающую клетку неинвазив-ную методику, вносящую наименьшее количество повреждений и уменьшающую таким образом погрешность метода измерений.
В качестве такого методики предлагается использовать разновидность лазерной интерфе-
* Адресат для корреспонденции: 119899 Москва, кафедра биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова; тел.: 939-19-66, факс: 939-11-15; e-mail: zagzone@ gmail.com.
ренционной микроскопии (ЛИМ) — неинва-зивной процедуры, способной создавать высококонтрастные изображения живых объектов без их модификации красителями. Помимо способности обеспечивать высококонтрастные изображения, что достигаемо и в других разновидностях микроскопии, например различными фазово-контрастными методами, ЛИМ позволяет количественно, с высокой точностью оценивать фазовую высоту (которая пропорциональна произведению толщины образца на его показатель светопреломления) [2]), что делает названную технику неким "бесконтактным" аналогом зондовых микроскопов (например, атомно-силового микроскопа, количественно оценивающего величину взаимодействия образца с зондом). Оценив фазовую высоту, можно дополнительно, при соблюдении ряда условий, рассчитать такие характеристики клетки, как форму, объем, показатель преломления, концентрацию и количество вещества в клетке, а также ряд других параметров.
В настоящей работе приводится пример использования техники ЛИМ для оценки степени повреждения макрофагов мышей, подвергшихся воздействию средневолнового, УФ-Б-излу-чения.
КРАТКАЯ ТЕОРИЯ ЛИМ
Принцип действия ЛИМ-микроскопа основан на измерении локальных фаз света, отраженного объектом. В приборе луч лазера разделяется на два, один из которых проходит через клетку, в результате чего может измениться его фаза. Другой луч является контрольным и не проходит через объект. При наложении отраженного и контрольного лучей формируется интерференционная картина (фазовое изображение объекта). Метод ЛИМ измеряет оптическую разность хода (ОРХ) двух лучей, иначе называемую фазовой высотой
(Ф) [2].
Фазовый портрет клетки представляет собой распределение величины ОРХ в различных областях объекта, а значение ОРХ в каждой точке i представляет собой сумму высот различных оптических сред zn, где п — коэффициенты светопреломления соответствующей среды, а пП1 — показатель светопреломления окружающего раствора
[3]:
= (П + п2 г2 + ... + ппгп) - пт1, (1) пт — показатель светопреломления среды.
Известно, что показатель светопреломления вещества в растворе линейно зависит от его концентрации (С) в растворе [4]:
n = nm + a C,
(2)
где а — экспериментально определяемый параметр, который зависит от типа вещества.
Используя ЛИМ, можно оценивать количество (т) вещества в клетке [3]:
m =
(n - nm)
Ф
(3)
где р — удельная плотность вещества (для белка 1.33—1.36 [4, 5]), п — показатель преломления вещества (для белка 1.5—1.6 [4]), Фтеап — среднее значение величины ОРХ в клетке, S — площадь клетки.
В случае клеток с однородным содержимым (например, безъядерные эритроциты, основным содержимым которых является гемоглобин) т, оцененное при помощи формулы (3), будет отражать реальное количество вещества. Однако в случае клеток с неоднородным содержимым (характерно для большинства клеток), в составе которых находятся различные вещества с разными показателями преломления, оцененное при помощи формулы (3) значение т будет отражать изменение общего количества некоего усредненного количества вещества в клетке без уточнения, какое именно вещество и в каком именно участке клетки количественно изменяется.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Метод выделения перитонеальных макрофагов мышей. Объектом исследования служили перито-неальные макрофаги мышей. Для их получения мышей забивали с помощью цервикальной дислокации, вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса (содержащего 10 моль/л HEPES; рН 7.2; "Serva") и через несколько минут извлекали перитонеальную жидкость, обогащенную макрофагами. Концентрацию клеток в полученной таким образом суспензии доводили тем же раствором до величины 1.5 х 106 клеток в мл. Небольшие объемы суспензии (30 мкл) наносили на покровные стекла, инкубировали в течение 45 мин во влажной камере (время, необходимое для адгезии клеток к поверхности стекла), а затем промывали раствором Хенкса для удаления неприкре-пившихся клеток [6]. Далее стекла помещают в чашки Петри, содержащие 2 мл указанного выше раствора.
Условия облучения. В качестве источника излучения использовали лабораторный спектральный облучатель "ЛОС-2" (СКБ БП АН СССР, г. Пущино). Облучение клеток проводили при интенсивности света 1 мВт/см2 на специально изготовленном стенде через интерференционный светофильтр с максимумом пропускания при ^max = 306 нм, входящий в комплект прибора в комбинации со стеклянным светофильтром УФС-5 для дополнительного подрезания красной компоненты. Интенсивность света регулировали изменением величины диафрагмы облучателя. В опытах использовали достаточно узкие полосы с полушириной 20 нм.
Метод определения клеток с поврежденной плазматической мембраной. Определение целостности плазматической мембраны макрофагов осуществляли, используя перекрестную окраску двумя флуоресцентными зондами: бромистым этидием и флуоресцеиндиацетатом в конечной концентрации 5 мкг/мл ("Serva") [6]. Клетки с неповрежденной мембраной определяли по зеленой флуоресценции флуоресцеина. При повреждении мембраны в клетки проникал этидиум бромид и, связываясь с ядерной ДНК, приводил к красному окрашиванию клеток [7]. Степень повреждения оценивалась как отношение числа поврежденных клеток к общему количеству клеток в популяции в процентах.
Получение фазовых изображений методом лазерной интерференционной микроскопии. Исследования проводили с использованием автоматизированного интерференционного микропрофиломет-ра, разработанного в институте ВНИИОФИ, (Москва, Россия) на базе микроинтерферометра Линника "МИИ-4" ("ЛОМО", Россия) [8]. В ходе
Степень повреждения макрофагов в зависимости от времени и дозы облучения
Номер группы Доза облучения, Дж/см2 Степень повреждения, % Степень повреждения, определенная с помощью ЛИМ, %
1 0 0 0
2 1.4 10.2 13.4
3 2.05 36 42.8
4 12 100 100
исследования использовали объектив х30 с апертурой 0.65. Размеры регистрируемого кадра составляли 195 х 145 мкм. Для получения кадров использовали программу Winphast, а также специальное программное обеспечение. Реконструкцию фазового изображения из интерференционной картины осуществляли с помощью метода фазового шага [9]. Для захвата изображений использована черно-белая 12-битная ПЗС видеокамера "VS-415U" ("NPK Videoscan", Russia), размер матрицы 6.5 х 4.83 мм, разрешение 782 х 582. В каждом опыте получены девять интерферограмм, время сохранения интерферограммы определялось временем экспозиции камеры (обычно 20 мс). Время сохранения изображения — менее 2 с, общее время получения фазового изображения составляло около 10 с (на стандартном РС "Pentium IV", 3.2 GHz, 1 Гб RAM, OS Windows XP). В качестве источника излучения использован полупроводниковый лазер с длиной волны 650 нм и мощностью 5 мВ (мощность излучения на объекте была менее 2 мВт).
На зеркальной подложке, содержащей каплю физиологического раствора и покрытой покровным стеклом, вертикальная чувствительность прибора не меньше чем ^/200, а латеральная разрешающая способность — не менее 0.5 мкм [10].
Обработка фазовых изображений. Обработку фазовых изображений, а также оценку площади, максимальной и средней величины ОРХ (фазовой высоты), проводили при помощи бесплатной для некоммерческого использования программы FIJI (http: //pacific .mpi-cbg. de/wiki/index.php/ Main_Page) — разновидности программы ImageJ. Дальнейшую статистическую обработку
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.