НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 1, с. 76-79
= МЕТОДЫ
УДК 577.175.823:577.171.6:577.113
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОТ-ИЦР ДЛЯ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ мРНК СЕРОТОНИНОВЫХ 5-НТ2А-РЕЦЕПТОРОВ в головном мозге
© 2004 г. А. В. Куликов1*, М. А. Тихонова1, И. П. Воронова2, Н. К. Попова1
1Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск 2Институт физиологии Сибирского отделения РАМН, Новосибирск
Приводится детальное описание и верификация применения метода обратной транскрипции - поли-меразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для полуколичественного определения интенсивности экспрессии мРНК серотониновых рецепторов 5-НТ2А-подтипа в структурах мозга. Контроль обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции осуществляется с помощью коамплификации в одной и той же пробирке мРНК гена 5-НТ2А-рецепторов и гена "домашнего хозяйства", в-актина, который служит внутренним стандартом. Интенсивность экспрессии мРНК рецепторов выражается по отношению к экспрессии мРНК в-актина.
Ключевые слова: ОТ-ПЦР, 5-НТ2А серотониновыерецепторы, мозг.
ВВЕДЕНИЕ
Серотониновые рецепторы 5-НТ2А-подтипа кодируются геном, включающим два интрона и локализованным на хромосомах 13 и 14 человека и мыши соответственно [1]. Рецепторы этого подтипа сопряжены с Gq-белками и при активации вызывают гидролиз фосфотидилинозитола-4.5-бисфосфата и увеличение внутриклеточной концентрации Ca+2 [2, 3]. Последнее в свою очередь сопровождается деполяризацией нейронов [4], их экспрессирующих. 5-НТ2А-рецепторы вовлечены в регуляцию многих важнейших физиологических функций, таких как сокращение гладкой мускулатуры и агрегация тромбоцитов. В мозге высокая плотность этих рецепторов обнаружена в коре и стриатуме, в то время как в гип-покампе рецепторы этого подтипа присутствуют в небольших количествах [5]. В центральной нервной системе 5-НТ2А-рецепторы вовлечены в регуляцию ряда стереотипных моторных актов, таких как рефлекс "мокрой собаки" (wet dog shakes), а также половой активации [6] и сна [7]. Наибольшее внимание привлекает ассоциация 5-НТ2А-рецепторов с такими психопатологиями, как депрессия, эпилепсия, мигрень, тревожные расстройства и шизофрения [5, 8]. В связи с этим изучение особенностей регуляции 5-НТ2А-рецеп-торов в мозге является актуальным и важным. Однако механизмы регуляции этих рецепторов до настоящего времени остаются еще неясными [8]. Имеется большое количество работ об изменении плотности 5-НТ2А-рецепторов при различных физиологических состояниях и фармакологических воздействиях. Однако регуляция экспрессии
* Адресат для корреспонденции: 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, д. 10; тел.: (3832) 32-31-01; e-mail: v_kulikov@bionet.nsc.ru
гена, кодирующего этот подтип рецепторов, до сих пор неясна, а имеющиеся работы единичны. Проблема осложняется низкой концентрацией мРНК 5-НТ2А-рецепторов в тканях мозга, что затрудняет использование метода Northern blot.
Одним из перспективных методов количественного изучения экспрессии генов считается обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). Было показано, что ОТ-ПЦР является в 1000-10000 раз чувствительнее, чем традиционный Northern blot [9]. Несмотря на множество нерешенных проблем, ОТ-ПЦР прочно вошла в арсенал методов современной нейроэндокринной лаборатории. В настоящее время имеются единичные публикации о применении ОТ-ПЦР для изучения экспрессии гена 5-НТ2А серотониновых рецепторов [10, 11]. Однако сама процедура ОТ-ПЦР в этих работах изложена довольно кратко, что затрудняет ее воспроизведение. Кроме того, в этих работах не приведен весь набор экспериментальных доказательств адекватности процедуры.
Цель данной работы - подробное изложение и верификация метода ОТ-ПЦР для полуколичественной оценки уровня мРНК 5-НТ2А-рецепторов в структурах головного мозга крыс и мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Половозрелые самцы крыс линии Вистар в возрасте 2 мес. были декапитированы. Быстро на холоду извлекали мозг и выделяли переднюю кору и гиппокамп, помещали в стерильные пробирки Эппендорф на 1.5 мл и замораживали жидким азотом. Пробы хранили при -66°С до выделения суммарной РНК.
Суммарную РНК выделяли экстракцией гуани-дин изотиоционатом и фенолом [12]. Целостность общей РНК оценивали с помощью электрофореза
5-HT
2A
413 п. н. 285 п. н.
ß-актин
н F Рч
Sc
л
т
о о
н
я
и
о
н
о
т н
S
100000 75000 50000 25000 0
0.0625 0.25
75000
50000
25000
0
1мкл 0.0625
Разведения раствора кДНК
0.25
1 мкл
Рис. 1. Зависимость интенсивности флюоресценции полос продуктов амплификации кДНК 5-ЫТ2д-рецепторов и Р-ак-тина, полученных из коры мозга крысы, от количества кДНК, взятого для ПЦР реакции. Верхний рисунок является снимком окрашенного бромистым этидием агарозного геля, содержащего продукты амплификации. Нижний рисунок представляет кривые зависимостей флюоресценции продуктов амплификации 5-ЫТ2д-рецепторов и Р-актина от начального количества кДНК. Здесь и на последующих рисунках фотографии продуктов амплификации даны в виде не-
гативов, в виде которых они используются для определения интенсивности полос программой Scion Image ряд - продукты амплификации 5-ЫТ2д-рецептора, нижний ряд - Р-актина.
TM
. Верхний
в 0.8% агарозном геле. Отсутствие примесей ДНК в препаратах РНК проверяли с помощью ПЦР-ана-лиза с использованием праймеров на ß-актин.
Для проведения обратной транскрипции в пробирке Эппендорф на 0.5 мл смешивали 1 мкг суммарной РНК, 180 нг рандомного праймера и 2.25 мкмоль стерильного KCl в объеме 16 мкл, денатурировали при 94°С в течение 5 мин, отжигали при 42°С в течение 15 мин и затем добавляли 15 мкл буфера, содержащего 200 ЕД обратной транскриптазы M-Mulv ("Биосан", Новосибирск, Россия), 0.225 мкмоль трис-НС1 (рН 8.1), 0.015 мкмоль каждого из четырех dNTP ("Сибэн-зим", Новосибирск, Россия), 0.225 мкмолей ДТТ и 0.03 мкмолей MnC12. Смесь (в конечном объеме 31 мкл) инкубировали при 41°С в течение 60 мин. Полученную кДНК хранили при -20°С. Для проведения ПЦР в стерильной пробирке Эппендорф на 250 мкл смешивали аликвоту в 1 мкл кДНК с 2.5 мкл смеси специфичных для гена 5-НТ2А-ре-цепторов праймеров (по 5 пикомолей каждого) и добавляли 14 мкл смеси, содержащей 0.8 е.а. Taq полимеразы ("Медиген", Новосибирск, Россия), 2 мкл буфера ПЦРх10 (KCl - 0.5M; трис-HCl (pH = = 9) - 0.1M; Triton X-100 - 1%), 1 мкл dNTP, 0.3 мкл 0.1 М MgCl2 и воду до конечного объема. Амплификацию проводили в режиме горячей крышки. Смесь денатурировали при 94°С в течение 4 мин и амплифицировали в течение 9 циклов (94°С - 1 мин, 58°С - 1 мин и 72°С - 1 мин). Затем в пробы добавляли по 2.5 мкл смеси праймеров для ß-актина (по 5 пикомолей каждого праймера), денатурировали при 94°С в течение 4 мин и амплифицировали в течение еще 23 циклов. Было показано, что при использовании 23 и 32 циклов не наблюдается насыщения амплификации фрагментов генов ß-актина и 5-HT2A-рецепторов соответственно. Праймеры для
амплификации фрагмента гена 5-HT2A-рецепторов (прямой 5'-TGCAGAATGCCACCAACTAT и обратный 5'-TGCCACAAAAGAGCCTATHAG) были подобраны на первый и третий экзоны гена, т.е. в геноме были расположены на расстоянии в несколько тысяч пар нуклеотидов, и проверены на специфичность по базе данных Fasta3. Соответствие нуклеотидной последовательности продукта амплификации размером 416 п.н. фрагменту мРНК 5-Ш^-рецепторов было подтверждено рестрик-ционным анализом с Alu I. Для амплификации фрагмента гена ß-актина были взяты праймеры, рекомендованные в литературе (прямой 5'-CG-GAACCGCTCATTGCC и обратный 5'-ACCCA-CACTGTGCCCATCTA) [9]. Продукты амплификации (20 мкл) смешивали с 5 мкл буфера для нанесения (0.35% оранжевого G в 30% сахарозе) и проводили электрофорез в 1%-ном агарозном геле и 0.5хТБЕ буфере при напряжении 100 V в течение часа. После окраски бромистым этидием гель сканировали на сканере для гелей BiometraTI3 в ультрафиолетовом свете (300 нм) и изображение полос продуктов ПЦР заносили в компьютер с помощью программы BioDocII™. Анализ изображения и величину полос 5-HT2A-рецептора и ß-актина проводили с помощью программы Scion Image (Scion Corporation, США; http://www.sci-oncorp.com ). Экспрессию мРНК 5-HT2A-рецепторов оценивали в условных единицах по отношение к экспрессии мРНК ß-актина (интенсивность флуоресценции полосы для 5-HT2A рецептора к интенсивности флюоресценции полосы для ß-актина).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор праймеров и числа циклов амплификации позволили избежать возможного мешающе-
78
КУЛИКОВ и др.
Кора
Гиппокамп
5-HT2A в-актин
мРНК 5-НТ2А-рецепторов 1.0 г
Рис. 2. Сравнение экспрессии 5-ЫТ2А-рецепторов и Р-актина в коре (первые четыре дорожки на верхней фотографии) и в гиппокампе (вторые 4 дорожки) крыс. Верхний рисунок - негатив фотографии геля, нижний - отношение интенсивности полос 5-ЫТ2А-рецепторов к Р-актину. Более высокая интенсивность полос для Р-актина в гиппокампе по сравнению с корой свидетельствует о тканеспецифической особенности в регуляции экспрессии этого гена. *р < 0.01 по сравнению с уровнем экспрессии в коре.
го влияния незначительных примесей ДНК. Действительно, праймеры для амплификации фрагментов 5-ЫТ2А были подобраны так, что на геномной ДНК между ними было расстояние несколько тысяч пар оснований, такой фрагмент ДНК не может быть амплифицирован. Возможное мешающее влияние незначительных примесей ДНК при амплификации фрагментов Р-акти-на было устранено снижением числа циклов до 23. Было показано, что ДНК в количестве меньше 20 нг в пробе не визуализируется при этом числе циклов амплификации.
В подобранных нами условиях зависимость интенсивности флуоресценции обоих продуктов амплификации от количества кДНК, добавленного в пробирку, была линейна в диапазоне от 0.0625 до 1.0 мкл раствора кДНК (рис. 1).
Экспрессия мРНК в коре головного мозга была значительно выше, чем в гиппокампе (рис. 2), что хорошо согласуется с имеющимися в литературе соотношениями плотности и экспрессии рецепто-
ров в этих структурах мозга, полученных методами ауторадиографии и in situ гибридизации [13].
Известно, что тиреоидэктомия вызывает снижение плотности 5-НТ2А-рецепторов у крыс [14, 15]. В
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.