== МЕТОДЫ
УДК 577.112.386+612.821.6
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ В НЕЙРОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
© 2012 г. А. В. Арутюнян1*, Ю. П. Милютина1, И. В. Залозняя1, А. В. Пустыгина1,
Л. С. Козина2, А. В. Кореневский1
1 Учреждение Российской академии медицинских наукНИИакушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН 2 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН
Рассмотрены экспериментальные модели, в которых использовались различные подходы, с помощью которых достигалось повышение содержания гомоцистеина в крови крыс: хроническое (на протяжении 1 мес) употребление метионина с питьевой водой (1 г/кг массы) или принудительное пероральное введение раствора метионина (0.1—0.15 г в небольшом объеме воды). Об эффективности выбранной модели гипергомоцистеинемии судили на основании определения содержания гомоцистеина и интенсивности перекисного окисления липидов в сыворотке крови. Установлено, что строго дозированное потребление метионина при его принудительном пероральном введении не сопровождается побочными явлениями (признаки обезвоживания и сифункулятоз), а также приводит к менее значительному, по сравнению с приемом с питьевой водой, разбросу данных содержания гомоцистеина в крови. О преимуществе данной экспериментальной модели свидетельствуют также данные о том, что при ее использовании наблюдаются четкие изменения в динамике содержания катехоламинов в гипоталамусе крыс.
Ключевые слова: гипергомоцистенемия, гомоцистеин, метионин, метиониновая нагрузка, нейроток-сичность.
Обмен метионина в нормальных условиях обеспечивает процессы метилирования ряда важных молекул клетки — нуклеиновых кислот, белков (в том числе гистонов) и мембранных липидов, происходящего при участии его производного — 8-аденозилгомоцистеина. При недостатке витаминов или избыточном образовании гомо-цистеина (ГЦ) происходит его спонтанное окисление в более стабильные сульфосоединения (в основном, в гомоцистеиновую кислоту — ГЦК), которые в силу стерической аналогии с глутама-том проявляют сильное токсическое действие на ионотропные и метаботропные рецепторы глута-мата [1, 2].
Повышенное содержание ГЦ способствует также подавлению экспрессии глутатионперок-сидазы и супероксиддисмутазы, что может усиливать токсический эффект свободных радикалов в структурах мозга [3, 4].
ГЦ и ГЦК относятся к известным факторам риска развития сердечно-сосудистых и нейроде-генеративных заболеваний, и их высокий уровень содержания в периферической крови (гиперго-моцистеинемия) является опасным проявлением дизрегуляции метаболизма, проявляющим особо
*Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3; тел./факс: (812) 328 98 91; e-mail: arutjunyan@aa3703.spb.edu.
разрушительное действие на развивающийся организм [5, 6].
Для исследования механизмов гипергомоци-стеинемии (ГГЦ) используются различные экспериментальные модели. Наиболее распространенной из них является потребление животными в хроническом эксперименте метионина с питьевой водой. Тест с нагрузкой метионином используется также в клинике для оценки состояния метаболизма гомоцистеина, особенно при диагностике умеренной ГГЦ, протекающей бессимптомно [7, 8].
Принимая во внимание, что потребление ме-тионина с питьевой водой носит неконтролируемый характер, и животные в условиях хронического эксперимента потребляют неодинаковое количество метионина, сравнили этот способ с моделью ГГЦ, вызванной принудительным введением животным раствора метионина. Исследование проводилось с целью выяснения влияния гипергомоцистеинемии на регуляцию эстраль-ных циклов самок крыс.
Критерием степени ГГЦ, помимо определения содержания ГЦ, было также исследование ТБК-активных продуктов сыворотки крови, поскольку ГГЦ способствует развитию окислительного стресса и вызывает усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [9, 10].
83
6*
50
40
30
20
10
контроль
метионин
Рис. 1. Общее содержание гомоцистеина в сыворотке крови самок крыс при потреблении метионина с питьевой водой. (* — р < 0.001).
70 60 50
ч
§ 40
кмо 30 м
20 10
0
5:40-6:20 9:35-10:10 11:15-11:55 Циркадианное время
контроль
метионин
Рис. 2. Изменение уровня гомоцистеина в сыворотке крови в различные интервалы циркадианного времени у животных, получавших метионин с питьевой водой. * — p < 0.001, достоверное отличие содержания гомо-цистеина в сыворотке крови животных, которые с питьевой водой потребляли метионин, от контрольных животных.
*
0
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты поставлены на 127 половозрелых белых крысах линии Щ81аг, которые были разделены на две группы. Животных первой группы поили в течение 30 дней питьевой водой, содержащей метионин в концентрации, общепринятой при использовании данной модели (1 г/кг массы), суточное потребление метионина при этом составляло около 0.1—0.5 г на животное. Животные второй группы на протяжении этого времени потребляли обычную воду, но им вводили метионин перорально через зонд в концентрации 0.12—0.15 г на животное.
Известно, что уровень ГЦ в крови подвержен суточным изменениям [11]. Поэтому был исследован уровень содержания ГЦ в сыворотке крови в различные временные интервалы в течение дня (фотоцикл — 12 ч свет : 12 ч темнота). Поскольку проводимые в лаборатории исследования посвящены влиянию ГГЦ на гипоталамическую регуляцию эстральных циклов, временные точки были выбраны, исходя из сроков формирования преовуляторного пика гонадолиберина на стадии проэструса (540—620 ч, 935—1010 ч и 1115-1155 ч циркадианного времени (ЦВ) — времени, отсчитываемого от начала дневной фазы экспериментальных суток). ГЦ определяли иммуноферментным методом с использованием тест-системы Ах^^ИеМ (Великобритания). Определение ТБК-активных продуктов осуществляли с использованием метода, описанного в работе [12].
Статистическая обработка данных проведена с использованием непараметрических U — критерия
Манна—Уитни, H — критерия Крускала—Уоллиса, а также Q — критерия Данна. Учитывая то, что характер распределения исследованных параметров (уровень гомоцистеина сыворотки, содержание ТБК-активных продуктов) неизвестен, результаты были представлены как медианы и интерквартиль-ные диапазоны (25—75% перцентили). Различия считались достоверными приp < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Модель ГГЦ при потреблении метионина с питьевой водой. На рис. 1—3 представлены данные о влиянии потребляемого с питьевой водой метионина на уровень содержания ГЦ в сыворотке крови крыс. В этих условиях концентрация ГЦ возрастает почти в 8 раз (рис. 1). Наиболее высокие значения ГЦ, как показано на рис. 2, характерны для периода формирования и терминации преовуляторного пика гонадолиберина (935—1010 ч и 1115—1155 ч ЦВ). При этом наблюдается большой разброс данных, что наиболее наглядно проявляется при расчете медианы и перцентилей (рис. 3).
Модель ГГЦ при принудительном пероральном введении метионина. Как видно из данных, приведенных на рис. 4, в исследуемой модели ГГЦ с дозированным потреблением животными метиони-на концентрация ГЦ в сыворотке крови возрастает более чем в 2 раза, что значительно меньше по сравнению с моделью хронического потребления метионина с питьевой водой. Тем не менее, характер изменения ГЦ в этих условиях сохраняется, причем повышение его содержания в период формирования и терминации преовуляторного
60 50
57.2
40
ь л
2 30
20 10
0
7.1 ■+■ 7.0
6.0
7.3
+ 5.9
4.7
6.8
+■ 5.8
5.1
36.8
16.6 11.9
37.5
12.7 11.4
24.1
14.7
5:40-6:20 9:35-10:10 11:15-11:55 5:40-6:20 9:35-10:10 11:15-11:55
контроль метионин
циркадианное время
Рис. 3. Суточное изменение содержания гомоцистеина в сыворотке крови самок крыс при потреблении метионина с питьевой водой. На рисунке отражены медианы, а также 25 и 75%-ные перцентили.
пика гонадолиберина (935—1010 ч и 1115—1155 ч ЦВ) является, как и в модели потребления метионина с питьевой водой, достоверным (рис. 5). Следует отметить, что при этом была обнаружена суточная динамика содержания ГЦ в сыворотке крови контрольных животных, характеризующаяся достоверным его вечерним снижением. Очевидным преимуществом этой модели ГГЦ является значительно менее выраженный разброс данных, о чем свидетельствуют результаты, приведенные на рис. 6. Таким образом, при пероральном введении метионина наблюдается умеренная, по сравне-
Рис. 4. Содержание гомоцистеина в сыворотке крови самок крыс при принудительном пероральном введении метионина. (* — р < 0.001).
нию с питьевой метиониновой нагрузкой, ГГЦ, однако она проявляется более равномерно у всех исследуемых животных.
О том, что в предложенной модели введение метионина приводит к ГГЦ, указывают также данные об изменении содержания ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови исследуемых крыс в этих условиях (рис. 7). При сравнении контрольной и опытной групп, в каждой из которых были
Циркадианное время контроль |Щ метионин
Рис. 5. Изменение уровня гомоцистеина в сыворотке крови в различные интервалы циркадианного времени у животных, при пероральном введении метионина. * — р < 0.01, достоверное отличие содержания гомоци-стеина в сыворотке крови животных, которым перо-рально вводили метионин от контрольных животных.
12
^ 9
7.7
7.2
6.8 1 6J
4- 5.7
Т 5.3
+
5.9 5.0 4.6
10.7 9.4
7.0
I
8.5 7.8
6.5
11.2
8.3 6.8
5:40-6:20 9:35-10:10 контроль 11:15-11:55 5:40-6:20 9:35-10:10 метионин 11:15-11:55
циркадианное время
6
3
0
Рис. 6. Суточное изменение содержания гомоцистеина в сыворотке крови самок крыс в контроле и при принудительном пероральном введении метионина. На рисунке отражены медианы, а также 25 и 75%-ные перцентили. С помощью метода Крускала—Уоллиса отмечена достоверная суточная динамика данного показателя в группе контроля (p < 0.01).
13.19 12.65
11.78
12.65
11.58 10.77
13.09 12.59
11.51
13.97
12.52 11.81
14.94 14.27 13.7
14.88 14
12.55
16 15 14
ч
> 13
ч о
312
11 10
9
циркадианное время
Рис. 7. Изменение содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке крови животных при пероральном введении метионина. На рисун
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.