научная статья по теме ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИСТЕМЫ АДАПТИВНОГО МУТАГЕНЕЗА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАННИХ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВ DE NOVO МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA METHANOLICA MH4 Биология

Текст научной статьи на тему «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИСТЕМЫ АДАПТИВНОГО МУТАГЕНЕЗА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАННИХ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВ DE NOVO МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA METHANOLICA MH4»

ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 10, с. 1361-1368

= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =

УДК 575.224:582.282.23

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИСТЕМЫ АДАПТИВНОГО МУТАГЕНЕЗА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАННИХ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВ de novo МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Pichia methanoliea MH4

© 2009 г. Т. А. Дутова, Н. Н. Мордкович, Ю. Д. Цыганков

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 113545; e-mail: t_dutova@genetika.ru Поступила в редакцию 25.09.2008 г.

У метилотрофных дрожжей Pichia methanolica получена коллекция спонтанных "романовских" мутантов (1654 шт.) по ранним генам биосинтеза пуринов PUR1-PUR5 от 16 исходных ade1(pur6) и ade2(pur7) штаммов. Ранее были идентифицированы два гена - бифункциональный ADE7,4(PUR2,5) и ADE5(PUR4). Для идентификации двух оставшихся ранних генов (ADE3 и ADE8) был применен новый подход: сопоставление спектров спонтанных "романовских" мутантов с относительными размерами генов (по длине полипетпидов в аминокислотных остатках, а.о.).

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae нами была выявлена значительная корреляция между относительными размерами генов и долей мутантов в спектре (анализ литературных данных). Данные по усредненной длине полипептидных продуктов генов пяти ранних стадий биосинтеза пуринов 22 видов низших эукариот были получены с использованием базы данных (PubMed). Для дрожжей P. methanolica нами также была выявлена корреляция между спектром спонтанных "романовских" мутантов и относительными размерами генов. На этом основании ген ADE3 был идентифицирован как PUR1, а ген ADE8 как PUR3.

Спонтанный мутагенез, приводящий к появлению "романовских" мутантов, вероятнее всего, связан с транскрипционной активностью ранних генов, что хорошо согласуется с полученными экспериментальными данными о корреляции спектра мутантов с размерами генов. Высказано предположение, что в основе эффекта Roman может лежать адаптивный мутагенез - усиление транскрипции ранних генов в ответ на стресс, накопление токсичных метаболитов (АИР или КАИР) при блоке 67-й стадии биосинтеза пуринов.

Большинство организмов обладают способностью к биосинтезу пуриновых нуклеотидов (БПН) de novo. Путь БПН консервативен у всех организмов, за исключением некоторых паразитических форм про- и эукариот, и включает 10 последовательных этапов до инозинмонофосфата (ИМФ) (рис. 1). Однако организация генов, контролирующих БПН, и их регуляция значительно различаются у разных видов и остаются предметом интенсивного изучения [1].

У дрожжей наиболее изучены гены ADE2 (PUR6) и ADE1 (PUR7), контролирующие 6-й и 7-й этапы БПН, кодирующие соответственно АИР-карбоксилазу и САИКАР-синтетазу. Дрожжи, мутантные по этим генам, образуют красные колонии в результате накопления в клетках пигмента - продукта полимеризации АИР или КАИР [2]. Система учета и отбора прямых мутантов ade2 (pur6) или adel (pur7) по фенотипу "от белого к красному" нашла широкое применение в генетических исследованиях дрожжей. Гораздо менее изучена и распространена другая система визуального отбора прямых мутантов на неселектив-

ной среде, получившая название "от красного к белому", где в качестве исходных штаммов служат мутанты pur6 или pur7. Известно, что у красных аденинзависимых мутантов S. cerevisiae мутации в любом из генов пяти ранних стадий биосинтеза пуринов (PUR1-PUR5) приводят к восстановлению белой окраски колоний, тогда как блокирование более поздних этапов биосинтеза пуринов не влияет на пигментацию. В 1956 г. Roman описал у S. cerevisiae эффект селективного преимущества таких двойных ауксотрофов, спонтанно возникающих в виде мелких белых колоний на поверхности красной колонии одиночного ауксотрофа при инкубации на полной среде [3]. Генотип спонтанных мутантов соответствует ade2(pur6) purx либо ade1(pur7) purx, где х - мутация PUR1-PUR5 генов. Тест-система учета прямых мутаций для другого вида дрожжей Schizosaccaromyces pombe, использующая мутационную систему Roman, разработана Loprieno на основе радиочувствительного штамма [4]. В усовершенствованной тест-системе S. cerevisiae для изучения процессов индуцированного мутагенеза используют делеционные мутанты

Aade2(pur6), чтобы исключить возникновение реверсий и вести отбор по цвету только прямых мутантов по ранним PUR1-PUR5 генам в рассевах красных колоний на полной среде [5].

Ранее у метилотрофных дрожжей Pichia meth-anolica в нашей лаборатории были получены индуцированные ade-мутанты, которые после проведения комплементационного и тетрадного анализа были отнесены к семи независимым генам ADE1-ADE7 [6, 7]. Два гена, мутанты по которым накапливали красный пигмент, генетическими и биохимическими методами были идентифицированы как ADE1(PUR6) и ADE2(PUR7) [7]. У нескольких мутантов ade1(pur6) и ade2(pur7) P. methanolica был обнаружен эффект Roman (ЭР) и получена коллекция спонтанных "романовских" мутантов по ранним генам биосинтеза пуринов. Анализ коллекции с использованием тестеров по генам ADE1-ADE7 определил три ранних гена биосинтеза пуринов: ADE3, ADE5 и ADE7,4. Дополнительно были выявлены спонтанные мутанты еще по одному гену, обозначенному как ADE8 [8]. Впоследствии были идентифицированы два ранних гена генетическими, биохимическими и молекулярно-генетическими методами: ADE7,4 как бифункциональный ген PUR2,5 и ADE5 как PUR4 [9, 10].

В настоящей работе проведена идентификация двух оставшихся ранних генов - ADE3 и ADE8 дрожжей P. methanolica на основании нового подхода с использованием баз данных по генам PUR1-PUR5 у разных видов грибов и анализа спектра "романовских" мутантов. Обсуждается природа ЭР у дрожжей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Среды. Составы полной среды YEPD, минимальной М, селективных AL-5 приведены в [6, 8]. Для штаммов, имеющих дополнительные ауксо-трофности, в среду М вносили кроме аденина аргинин или гистидин в концентрациях 20 мг/л. Для увеличения эффективности скрещивания использовали среду Мал-3, вариант среды М, с заменой глюкозы на 3%-ную мальтозу.

Штаммы. Исходные штаммы и тестеры для получения и идентификации коллекции "романовских" мутантов представлены в табл. 1. Часть коллекции (375 шт.) "романовских" мутантов была проанализирована нами ранее, причем два исходных штамма с мутациями ade1-4 и ade2-3 проявляли максимальный ЭР [8]. Общая выборка полученных нами мутантов составила 1654 шт. Для идентификации полученных в настоящей работе спонтанных мутантов использовали набор тестеров P. methanolica по генам ADE1-ADE7 [6-8]. Тестерами служили одиночные мутанты МН4-16 и МН4-81 и спонтанные "романовские" мутанты

5,10-метилен-ТГФ

ADE3 10-формил-ТГФ

ФРПФ

I ADE4 ФРА

„ ADE5,7 ГАР

ADE8 ФГАР

ADE6

ФГАМ

ADE5,7 АИР -

"ADE2 Образование красного пигмента в вакуоле

КАИР -

-ADE1 САИКАР

ИМФ

Рис. 1. Схема биосинтеза пуринов de novo у дрожжей Saccharomyce cerevisiae. Аббревиатура, интермедиаты и гены: ФРПФ - 5'-фосфорибозил-1-пирофосфат; ФРА -5'-фосфорибозил-1-амин; ГАР - 5'-фосфорибозилглици-намид; ФГАР - 5'-фосфорибозил^-формилглицинамид; ФГАМ - 5'-фосфорибозил^-формилглицинамидин; АИР - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол; КАИР -5'-фосфорибозил-4-карбокси-5'-аминоимидазол; САИКАР - 5'-фосфорибозил-4-^-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол; ИМФ - инозинмонофосфат; гены: ADE4 - фосфорибозилпирофосфат амидотрансфераза; ADE 5,7 - глицинамид риботид синтетаза и аминоимида-зол риботид синтетаза; ADE8 - глицинамид риботид трансформилаза; ADE6 - 5'-фосфорибозил-формилг-лицинамид-синтетаза; ADE2 - фосфорибозиламино-имидазол-карбоксилаза; ADE1 - фосфорибозил-ами-но-имидазол-сукцинокарбозамидсинтетаза.

или их одиночные сегреганты такие, как МН4-34, МН4-196, МН4-762 и МН4-785.

Получение мутантов. Методы отбора по Roman двойных спонтанных аденинзависимых мутантов с модификациями подробно описаны ранее [8]. Для идентификации полученных мутантов их скрещивали с набором тестеров. Для повышения эффективности скрещивания использовали среду Мал-3, что облегчало отбор прото-трофных гибридов на среде М. Сравнение белковых продуктов ранних генов PUR1-PUR5 у 22 видов дрожжей и грибов проведено с использованием базы данных PubMed. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Protein).

Таблица 1. Генотипы исходных и тестерных штаммов P. methanolica

Исходные штаммы Генотип Штаммы-тестеры Генотип

MH4-1 ade1-1 MH4-16 ade3-16

MH4-3 ade2-3 MH4-34 ade8-34s

MH4-4 ade1-4 MH4-81 ade4-81

MH4-5 ade1-5 MH4-199 ade1-1 ade7-199s

MH4-6 ade1-6 MH4-612 ade2-3 ade7,4s

MH4-17 ade1-17 MH4-615 ade 1-17 ade7,4-615s

MH4-19 ade1-19 MH4-617 ade 1-17 ade7-617s

MH4-162 mat а 46 ade2-3 MH4-622 ade 1-17 ade4-622s

MH4-642 ade2-3 arg2 MH4-623 ade 1-17 ade4-623s

MH4-670 ade2-3 his4 MH4-628 ade1-19 ade7,4-628s

МН4-763 ade1-4 his4 MH4-630 ade 1-5 ade8-630s

МН4-764 ade1-4 his1 MH4-762 ade5-631s

MH4-931 mat а 46 ade1-4 MH4-785 ade7,4-628s

MH4-2057 ade1-2057 arg1 MH4-779 ade7-196s

MH4-2063 ade1-2063 arg1

MH4-2065 ade1-2065 arg1

Примечание. s - спонтанная мутация.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для идентификации генов ADE3 и ADE8 дрожжей P. methanolica нами был разработан и использован новый подход на основе сравнения спектров спонтанных "романовских" мутантов и размеров генов (сумма аминокислотных остатков в полипептиде, а.о.), контролирующих пять ранних стадий биосинтеза пуринов.

У дрожжей сахаромицетов неоднократно отмечали сдвиг в спектре индуцированных и спонтанных мутантов по паре генов ADE1(PUR7) и ADE2(PUR6) в сторону мутантов ade2, что согласуется с большим размером гена ADE2(PUR6) по сравнению с геном ADE1(PUR7) (размеры полипептидов 571 и 306 а.о.) [11-14]. Опираясь на предположение, что спектр прямых мутаций может отражать размеры генов, были проанализированы литературные данные для S. cerevisiae по ранним генам PUR1-PUR5, включающие как спектры спонтанных "романовских" мутантов, так и данные по длине полипептидных продуктов соответствующих генов.

В период 1956-1972 гг. в четырех разных лабораториях были получены коллекции "романовских" мутантов от трех независимых исходных культур, общая выборка которых составила 2878 мутантов [3, 15-17].

Размеры полипептидов ранних генов биосинтеза пуринов для дрожжей

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»