НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 3, с. 236-243
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.352.38;616.853.9
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ НОВОГО ТРИПТАМИНОВОГО ПРОИЗВОДНОГО СЕКУРИНИНА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА СУДОРОЖНУЮ АКТИВНОСТЬ МОЗГА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭПИЛЕПСИИ © 2011 г. М. Е. Неганова1, *, В. А. Блик2, С. Г. Клочков1, Н. Е. Чепурнова2, Е. Ф. Шевцова1
Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка, Россия 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
В данной работе изучались механизмы антиоксидантной активности триптаминового производного секуринина (ТПС) и его влияние на динамику судорожной активности на различных моделях эпилепсии. Было показано, что новое ТПС, обладая антиоксидантным и хелатирующим эффектом, проявляет противосудорожное действие в литий-пилокарпиновой модели эпилепсии и представляет интерес в качестве потенциального скаффолда при разработке новых противосудорожных ней-ропротекторных препаратов.
Ключевые слова: производное секуринина, антиоксиданты, нейропротекторы, перекисное окисление липидов, модели эпилепсии.
ВВЕДЕНИЕ
Эпилепсия — одно из самых распространенных заболеваний нервной системы, которое представляет серьезную медицинскую и социальную проблему. Это хроническое заболевание головного мозга, характеризующееся повторными непровоцируе-мыми приступами с нарушением двигательных, чувствительных, вегетативных, мыслительных или психических функций, возникающих вследствие чрезмерных нейронных разрядов [1]. Несмотря на заметный прогресс в изучении патогенеза, в диагностике и лечении эпилепсии, до 30% пациентов в наиболее богатых странах мира и до 60—90% в России относятся к случаям, в которых не удается добиться контроля над припадками и адекватной социальной адаптации [2]. Ситуация осложняется тем, что существует множество типов эпилепсии и эпилептических припадков, и препараты, успешно используемые в одном случае, в другом оказываются неэффективными.
Наиболее тяжелое состояние возникает при эпилептическом статусе (ЭС), который характеризуется непрерывными или часто повторяющимися приступами без полного восстановления сознания [3]. ЭС не является просто серией припадков, но представляет собой качественно иное состояние, при котором происходит тяжелое расстройство систем жизнеобеспечения организма, что нередко ведет к летальному исходу [4]. В результате судорожных
* Адресат для корреспонденции: 142432 Московская область, г. Черноголовка, Северный проезд, д. 1; тел.: 8(962)937-68-69; e-mail: neganova83@mail.ru.
приступов возникает синаптическая дезорганизация, сопровождающаяся нейрональной сверхчувствительностью и превалированием возбуждения над торможением. Могут возникать посттравматические воспалительные и другие экзогенные поражения мозга, нарушения в системе капилляр-ней-рон-глиоцит. При вовлечении больших популяций нейронов и отдельных структур мозга в эпилептический процесс могут возникать нарушения, характер которых определяется той функцией, за которую отвечает данная структура : когнитивные нарушения, кататония, изменение поведения и личности, память и другие отклонения. В связи с этим задачей клиницистов является не только купирование эпилептиформных приступов, но и снижение их длительности и остроты, а также защита мозга от нейродегенеративных процессов.
Окислительный стресс играет заметную роль в патогенезе эпилепсии. Он не только является одним из важных последствий избыточной нейронной активности, но и может принимать участие в инициации и развитии судорог. В настоящее время получены данные, что генерация свободных радикалов во время эпилептической активности играет значимую роль в гибели нервных клеток [5].
Перспективным направлением является поиск лекарственных средств в ряду биологически активных веществ природного происхождения, так как они в большинстве случаев обладают хорошей переносимостью и широким спектром действия. В то же время направленная химическая модификация природных веществ позволяет придать им новые свойства.
В Институте физиологически активных веществ РАН было синтезировано новое триптаминовое производное секуринина (ТПС) — вторичного метаболита растения семейства ЕыркогЫасеае. Было обнаружено, что ТПС обладает антиоксидантной, мито- и цитопротекторной активностью [21]. Известно, что некоторые антиоксиданты и хелаторы металлов переменной валентности оказывают ней-ропротекторное и противосудорожное действие на различных моделях, а также в клинической практике при использовании в качестве дополнительной терапии [6, 7]. На основании этих данных мы предположили, что исследуемое нами соединение может оказывать противоэпилептическое действие.
Данная работа посвящена исследованию механизмов антиоксидантных свойств производного се-куринина и изучению его влияния на судорожную активность у животных в двух экспериментальных моделях с различными механизмами инициации эпилептической активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Приготовление гомогената мозга крыс. Для экспериментов использовали самцов белых нелинейных крыс весом 300—400 г. Животные имели свободный доступ к корму и воде. Декапитацию наркотизированных СО2 животных проводили с помощью гильотины. Мозг гомогенизировали в 120 тМ КС1/20 тМ Нере8 на холоду. Для получения субклеточной фракции гомогенат мозга центрифугировали при 4000 об/мин и работали с супер-натантом. Приготовленный гомогенат мозга использовали в эксперименте в этот же день.
Определение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ). ПОЛ гомогената мозга крыс определяли по содержанию малонового диальдеги-да (МДА), определяемого в реакции с тиобарбиту-ровой кислотой (ТБК) [8]. Инициирование процесса ПОЛ проводили Fe3+ (FeNH4 ^04)2 • 12Н20) или трет-бутилгидропероксидом (т-БГП). Регистрировали оптическую плотность на плашечном ридере УеШг 3 (РегктЕ1тег) при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали гомогенат мозга крыс без добавления инициатора ПОЛ. Эквивалент МДА рассчитывали, используя коэффициент калибровки с 1,1,3,3-тетраэтоксипропаном и соотносили данные к количеству белка в пробе.
Определение Ее2+-хелатирующей активности.
Fe2+-хелатирующая активность определялась по модифицированной методике [9]. Данная методика основана на способности образования стойкого окрашенного комплекса Fe2+ с феррозином с пиком поглощения 562 нм.
Для того чтобы исключить вероятность связывания исследуемых веществ с феррозином, были сняты спектры в диапазоне 300—800 нм феррозина в чистом виде и в присутствии вещества [10].
Определение антирадикальной активности. Антирадикальную активность определяли с использованием стандартного модельного стабильного радикала дифенилпикрилгидразила (ДФПГ). При взаимодействии ДФПГ с соединениями, которые обладают подвижным атомом водорода (тиолы, фенолы, амины, амиды и др.), этот радикал восстанавливается, что сопровождается уменьшением пика поглощения при 517 нм.
Животные. Работа выполнена на белых, серых и черных мышах (самцы и самки). Различий в проявлении судорог не наблюдалось. Животные содержались в условиях стандартного вивария с 12-часовым световым режимом и свободным доступом к воде и пище.
Сравнение судорожной активности секуринина и его триптаминового производного (ТПС). Мышам первой опытной группы вводили секуринин вну-трибрюшинно в дозе 20 мг/кг в объеме 50 мкл DMSO. Мышам второй опытной группы вводили такую же дозу ТПС. Контрольным мышам вводили соответствующий объем DMSO. Мышей помещали в прозрачные боксы для наблюдения. Оценивали состояние мышей каждую минуту в течение 30 минут по пятибалльной шкале [11]:
0 баллов — нормальное поведение
1 балл — ненормальное поведение, затаивание
2 балла — подергивания мыщц головы и шеи
3 балла — вздрагивания всего тела, "встряхивания мокрой собаки"
4 балла — клонические судороги, поза "кенгуру"
5 баллов — тяжелые тонико-клонические судороги с полной потерей позы
Влияние ТПС на развитие ПТЗ-вызваннъх судорог. Пентилентетразол (ПТЗ) вводили мышам внут-рибрюшинно в дозе 25 мг/кг (концентрация 6.25 мг/мл в физиологическом растворе) три раза с интервалом 15 минут [12]. Мышам опытной группы до первого введения ПТЗ в течении 10 дней вводили внутрибрюшинно ТПС в дозе 20 мг/кг в DMSO, а мышам контрольной группы — соответствующий объем DMSO. В течение 15 мин после каждого введения ПТЗ ежеминутно оценивали тяжесть судорог по пятибалльной шкале.
Влияние ТПС на развитие судорог в литий-пило-карпиновой модели эпилептического статуса. Мышам вводили LiC1 в дозе 3 мэкв/кг в физиологическом растворе внутрибрюшинно. Через 24 ч вводили пилокарпин в дозе 70 мг/кг (в физиологическом растворе) внутрибрюшинно [13]. За 15 мин до введения пилокарпина мышам опытной группы вводили внутрибрюшинно ТПС в дозе 20 мг/кг в DMSO, а мышам контрольной группы — соответствующий объем DMSO.
Оценивали тяжесть судорог по пятибалльной шкале каждую минуту в течение 2 ч. Через 2 ч бло-
Рис. 1. Исследуемые вещества: а — секуринин, б — триптаминовое производное секуринина (ТПС).
МДА
нмоль/мг белка 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4
10
100 С, мкМ 1000
Рис. 2. Влияние секуринина и ТПС на перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс, инициированное Fe3+ . а — секуринин, б — ТПС.
Ре2+хелатирующая активность, %
75 65 55 45 35 25 15 5
-5* - 20
Рис. 3. Fe2+-хелатирующая активность секуринина и ТПС. а - секуринин б - ТПС.
40
60
80 100 С, мкМ
кировали судороги введением паральдегида внутрибрюшинно в дозе 0.6 мл/кг (в 10%-ном растворе).
По результатам экспериментов строили графики зависимости средней тяжести судорог для каждой из групп от времени с момента введения пилокар-пина/ПТЗ.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 5.5 (T-test, Mann—Whitney ^Test, уровень значимостиp < 0.05).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В ходе направленной химической модификации на основе природного алкалоида секуринина было синтезировано новое триптаминовое производное (рис. 1).
Антиоксидантная активность ТПС. Секуринин не проявляет антиоксидантной активности ни в случае Fe3+, ни в случае т-БГП-инициированно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.