9
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 2 * 1993
УДК 577.113.6.088.53:543.422.25
© 1993 г. Е. В. Вязовкина, И. В. Энгельс*, А. В. Лебедев
ИССЛЕДОВАНИЕ ДИАСТЕРЕОМЕРОВ НЕИОННЫХ АНАЛОГОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ VIII* ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНЫХ КОНФИГУРАЦИЙ ПРИ АТОМЕ ФОСФОРА ДИАСТЕРЕОМЕРОВ ДЕЗОКСИДИНУКЛЕОЗИДМЕТИЛФОСФОНАТОВ МЕТОДОМ ДВУМЕРНОЙ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ ROESY
Новосибирский институт биоорганической химии Сибирского отделения РАН;
* Институт органической химии Университета им. Гете, Франкфурт-на-Майне
Методом двумерной ЯМР-спектроскопии исследованы 16 пар индивидуальных диастереомерои дезоксидинуклеозидметилфосфонатов общей структуры [(MeO)2Tr]Np<CH3)N(Ac), где N-и N' — защищенные по экзоциклическим аминогруппам гетероциклов остатки нуклеозидов. Проведено отнесение сигналов протонов гетероциклических оснований, дезоксирибозы, мстипфосфонатного фрагмента, защитных групп. В спектрах ROESY обнаружены кросс-пики взаимодействия метилфосфо-натного фрагмента с протонами дезоксирибозы и гетероциклических оснований. Найдены 3áKOHO-мерности, связывающие интенсивности ряда характерных ROESY-сигналов с конфигурацией при асимметрическом атоме фосфора метилфосфонйтной группы диастереомеров. Полученные результаты в совокупности с литературными данными позволили определить абсолютные конфигурации всех 32 диастереомеров.
Олигодезоксинуклеозидметилфосфонаты, аналоги олигодезоксинуклеотидов, содержащие неприродную межнуклеозидную связь —О—Р.(СНз) (О)—О—, являются перспективными заменителями природных олигонуклеотидов при использовании их в качестве антисмысловых олигонуклеотидов [2, 3]. Однако основная проблема, сдерживающая их широкое применение,— особенность их структуры, заключающаяся в том, что наличие четырех различных заместителей при каждом межнуклеозидном атоме фосфора обусловливает существование таких производных в виде 2"-диастереомеров для олигонуклеотида, содержащего п асимметрических атомов фосфора. Диастереомерный характер таких молекул обусловливает различие их физико-химических свойств, таких, как растворимость, параметры спектра кругового дихроизма, хроматографические характеристики [4—6 ]. Резко различаются и биологические свойства диастереомеров [7, 8 ]. Поэтому для правильной интерпретации результатов физико-химических и биологических экспериментов необходимо использовать олигомеры с заранее известной конфигурацией. Пока не разработан стереоселективный метод синтеза гетерогенных олигодезоксинуклеозидметилфосфонатов, разделение диастереомеров методом хроматографии на силикагеле [4 ], обращенно-фазовой [5 ] или аффинной хро-
Сообщение VII см. [1]. Для краткости префикс «d» в обозначении дезоксинуклеотидов опущен, защитные группы в большинстве случаев не. приведены, поэтому следует учитывать, что обозначения GA, СЛ и т. п. соответствуют не свободным, а защищенным динуклеозидметипфосфонатам (если не указаны специально). Использовались 4,4'-диметокситритильная для защиты 5'-гидроксила, ацетильная — для З'-гидроксила, изобутирильная (ib) — для 2-МНг-фуппы гуанина и бензоильные группы для защиты экзоциклических аминогрупп аденина и цитозина (исключения — см. в подписи к табл. 2).
Литературные данные по установлению абсолютных конфигураций при атоме фосфора свободных диастереомеров дезоксидинуклеозидметилфосфонатов (во всех случаях — для изомера с меньшим временем удержания из каждой пары диастереомеров при обращенно-фазовой ВЭЖХ)
Диастереомер со- Конфигурация по данным метода
става ЯМР (МОЕ) ЯМР (ЙОЕ) Рентгеноструктурный анализ Стереоселективная реакция
АА Яр [9] ЯР [5]
СС Яр [5]
тт Ир [10] ЯР [9] ЯР [5]
во Яр [5]
АТ Др [11] Др [Ю] Яр [12]
ТА Яр [10]
СО Яр [10] Яр [13]
СА яР [11]
ГС Яр [11]
матографии [6 ] — наиболее приемлемый метод получения индивидуальных диастереомеров, но в таком случае необходимо определение абсолютной конфигурации при атоме фосфора в полученных олигонуклеозидметилфосфонатах. Первым шагом в этом направлении должно быть определение абсолютных конфигураций для всех 16 пар диастереомеров дезоксидинуклеозидметилфосфонатов. К настоящему времени проведено отнесение абсолютных конфигураций лишь для некоторых диастереомеров (табл. 1).
Наиболее многообещающим оказался подход, предложенный Лёшнером и Энгельсом в работе [10], в которой конфигурации определяли методом двумерной ЯМР-спектроскопии ЯОЕБУ. На примере нескольких пар диастереомеров было показано совпадение полученных отнесений с отнесениями, проведенными другими методами. В своей основе метод 1ЮЕ$У базируется на тех же принципах, что и метод ЫОЕБУ (см., например, обзор [14]). Наиболее существенное различие между ними заключается в том, что для молекул с молекулярной массой 1000 (именно такая молекулярная масса у динуклео-зидметилфосфонатов) при использовании метода ЬЮЕЗУ эффекты практически не детектируются в связи с тем, что соответствующая скорость кросс-релаксации протонов близка к нулю из-за получающегося соотношения времени корреляции молекулы и рабочей частоты спектрометра. В случае применения методики ИОЕ8У во всем диапазоне молекулярных масс (и соответствующих времен корреляции) скорость кросс-релаксации всегда положительна и интенсивность 1£ОЕ-с,игналов может достигать 20—34% от интенсивности диагонального сигнала.
В настоящей работе приведены результаты исследований всех 32 диастерео-мерных защищенных дезоксидинуклеозидметилфосфонатов методом ЯОЕБУ. Публикуемые данные позволяют сделать однозначные выводы об абсолютной конфигурации при асимметрическом атоме фосфора для всех диастереомеров.
На первом этапе работы было проведено отнесение всех сигналов протонов гетероциклических оснований, Сахаров и защитных групп и соответствующих кросс-пиков в спектрах ЯОЕ8У для всех дезоксидинуклеозидметилфосфонатов. В отдельных случаях не удалось провести полного отнесения сигналов в ароматической области спектра из-за перекрывания сигналов диметокситритильной и бензоильной защитных групп. Были определены значения химических сдвигов сигналов протонов Р—СНз-группы для пар диастереомеров (табл. 2). В большинстве случаев химический сдвиг сигнала протонов Р—СНз первого диастере-
Кросс-взаимодействие в спектрах {ЮЕ^У и химические сдвиги сигналов протонов Р—СНз-группы Использованные защитные группы (исключения см. в примечаниях) и нумерацию диастереомсров динуклеозидметилфосфонатов (здесь и во всех случаях порядок совпадает с И9-и ^-конфигурациями при атоме фосфора) см. в тексте статьи, Н5' и Н5" — протоны, имеющие более высоко- и низкопольные химические сдвиги соответственно. Плюс означает наличие кросс-взаимодействия (число плюсов характеризует интенсивность сигнала), минус — отсутствие взаимодействия; данные для перекрывающихся сигналов приведены в скобках
Защищенный диастереомер метилфосфоната состава Кросс-взаимодействия с протоном &снз, м.д.
5'-фрагмент 3'-фрагмент
H3' H4' Н5' Н5" НЗ' Н4' Н5' Н5"
GG1 +++ -н- + + (-) ++ ++ 1,45
GG2 +++ - - (+) + -н- ++ 1,45
GA1 * ++ +++ + + - (+) + + 1,45
GA2 * +++ ++ + + + ++ + + 1,45
GT1 ++ ++ - - - (++) ++ ++ 1,47
GT2 ++ - - - ++ ++ ++ ++ 1,55
GC1 +++ +++ + + - + ++ ++ 1,54
GC2 +++ ++ - - ++ ++ ++ 4+ 1,58
AGI ++ ++ - - + (++) ++ ++ 1,55
AG2 +++ - - ++ ++ ++ 1,50
АА1 ** +++ ++ - + ++ ++ 1,63
АА2 -H-+ - + ++ ++ 1,63
ATI +++ ++ - - - + ++ ++ 1,48
АТ2 +++ + - - + ++ -н- ++ 1,51
АС1 +++ (++) + + + (+) + + 1,50
АС2 +++ - - - - (+++) + + 1,51
TGI * ++ +++ + + ++ ++ -н- ++ 1,53
TG2 * ++ + - - + + ++ ++ 1,50
TAI *** +++ ++ + + (+) + + 1,33
TA2 *** +++ + - - + (+) + + 1,38
TT1 *** +++ (+) + + - (+) ++ ++ 1,46
ГТ2 *** +++ + - - -н- +++ ++ ++ 1,50
TCI *** +++ +++ - - - ++ ++ 1,42
TC2 *** +++ - - (+) +++ ++ ++ 1,48
CGI + ; + + + + ++ + + 1,47
CG2 +++ (+) - - - + ++ ++ 1,47
CAI ■H-f +-Н- ++ -н- + + ++ 1,35
CV2 +++ + + + 4- ++ ++ ++ 1,47
Cil ++ + + + - (+) ++ ++ 1,45
CT2 +++ + - - +++ ++ ++ ++ 1,55
CCI ++ (+) + + - (+) + + 1,45
CC2 +++ + - - ++ ++ + + 1,52
* Не содержится 5'-защитной группы.
** Приведены результаты работы [10], где данные по протонам Н(5',5") отсутствуют.
*** Использована 5'-0-Ме0Тг-защитная группа.
омера по сравнению со вторым находится в более сильном поле . Однако для пар диастереомеров состава GG, GA, CG и АА химические сдвиги метилфосфо-натных протонов совпадают, а для пар состава AG и TG реализуется обратный порядок.
Полные ROESY-спектры пары диастереомеров метилфосфоната [(МсОг/Гг |-< хТг(СНз)ЬгА(Ас) (TAI и ТА2) с отнесением сигналов протонов, представленные в качестве примера (рис. 1), демонстрируют наличие большого количества кросс-пиков, соответствующих взаимодействиям протонов дезоксирибозы с протонами
* Нумерация диастереомеров — в порядке выхода с колонки при хроматографии на силикагеле.
I I-,-,-t-1-,--,-,—,—,--,-,—
8,50 7,50 8, SO 5,50 4,50 3,50 Z,50 1,50
Рис. 1. Двумерные спектры ROESY первого <KP) (а) и второго (Sp) (б) диастереомеров [ (МеО) гТг] Тр (СНз) bzA (Ас)
i-CHj Р-СНд
lz,00
-3,00
4,00
6,00
•7,DD
■8,00
9,00
5,00 t,oo д,оо г, oo
Рис. 1 б
гетероциклического основания, протонов диметокситритильной группы с протонами 5'-концевого нуклеозидного остатка, межпротонным взаимодействиям в дезоксирибозе. Однако анализ показывает, что в спектрах отсутствуют кросс-пики, указывающие на взаимодействия между 5'- и 3'-концевыми нуклеозидными
фрагментами. Протоны Р—СНз-группы взаимодействуют с протонами обоих нуклеозидов и диметокситритильной группы. Аналогичные результаты были получены для всех исследованных димеров (спектры не приводятся).
Был проведен полуколичественный анализ взаимодействий протонов Р—СНз-группы для всех димеров. Результаты представлены в табл. 2 с указанием относительных интенсивностей кросс-пиков. Из-за частичного перекрывания сигналов протонов Н(4') и Н(5',5") дезоксирибозы и метальных сигналов Р—СНз-и тимидиновых 5-СНз-групп в ряде случаев оказалось возможным провести только приблизительную оценку относительных интенсивностей сигналов (приведены в скобках).
Известно, что интенсивность кросс-пиков в спектрах ROESY (/) связана с расстоянием м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.