РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2010, том 4(13), № 2, с. 187-191
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ TLR9 И BD-2 В КЛЕТКАХ РОГОВИЦЫ НА МОДЕЛИ ГЕРПЕТИЧЕСКОГО КЕРАТИТА У МЫШЕЙ
© 2010 г. В.А. Черешнев1, Л.В. Ганковская2, Л.В. Ковальчук2, М.В. Черешнева1, О.А. Ганковская3, Т.В. Гаврилова4, Ю.А. Воробьева2,3
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия;
2ГОУ ВПО РГМУРосздрава, Москва, Россия;
3НИИвакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия;
4Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Поступила: 13.05.2010. Принята: 27.05.2010
Механизмы врожденного иммунитета играют важную роль в патогенезе вирусного кератита. В настоящей работе на модели герпетического кератита у мышей линии С57В1/6 изучена динамика экспрессии гена TLR9 — одного из ключевых рецепторов, распознающего CpG-повторы ДНК вируса герпеса, и гена противомикробного пептида BD-2. Экспрессия исследуемых генов определялась с помощью обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени. Получены новые данные о достоверном снижении экспрессии гена TLR9 у мышей, инфицированных вирусом. Экспрессия гена BD-2 при этом не отличалась от показателя в группах сравнения. Не исключено, что выявленные изменения вызывает вирус простого герпеса 1 типа, блокируя TLR-опосредованный воспалительный ответ на уровне молекулы TRAF6. Модель вирусного кератита позволит исследовать механизм действия иммунотропных препаратов и оценить эффективность их применения в комплексной терапии офтальмогерпеса.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, герпетическая инфекция, кератит, экспрессия генов, Toll-подобные рецепторы, р-дефенсин 2
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время особое внимание уделяется изучению офтальмогерпеса в связи с широкой распространенностью, частыми рецидивами. Среди всех заболеваний роговицы основную часть составляют герпетические кератиты [1, 2]. Вирус герпеса простого 1 типа (ВПГ-1) считается причиной от 40 до 67% поражений роговицы и одной из причин слепоты, развивающейся вследствие вирусного кератита [3, 4].
В свете современных представлений, основное значение в защите тканей глаза от инфекционных агентов (бактериальных и вирусных) принадлежит факторам врожденного иммунитета [5, 6]. Основными распознающими рецепторами системы врожденного иммунитета являются паттерн-распознающие рецепторы (ПРР), распознающие уникальные
Адрес: 117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1, РГМУ, кафедра иммунологии. E-mail: oksgan@yandex.ru
структуры, общие для различных микроорганизмов. Наиболее древними среди них являются сигнальные То11-подобные рецепторы (ТЬКз). Активация этих рецепторов индуцирует каскад адаптерных молекул и приводит к выработке про- и противовоспалительных цитокинов, хемокинов, интерферонов 1-го типа, противомикробных пептидов (ПМП), действие которых направлено на элиминацию патогенов [5 — 7].
Имеются единичные исследования по изучению сигнальных молекул ТЬИз и ПМП в тканях глаза [6, 8, 9]. Изучение экспрессии гена ТЬИ9, одного из ключевых рецепторов, распознающего неметилированные СрС-по-вторы ДНК вируса, и эффекторной молекулы Р-дефенсина-2 (ББ-2), обладающего прямым противовирусным действием, позволит оценить роль механизмов врожденного иммунитета в патогенезе герпетического кератита.
Цель работы — исследовать динамику уровней экспрессии генов ТЬИ9 и ББ-2 эпите-
188
В.А. Черешнев и др.
лиальными клетками роговицы в норме и на модели герпетического кератита у мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование экспрессии TLR9 и BD-2 было проведено на модели вирусного кератита у мышей. За основу нами была взята модель, предложенная T.Wuest с соавторами, с некоторыми модификациями [10]. В наших исследованиях были использованы мыши линии С57В1/6, самцы, весом 18—19 г. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с правилами 3Rs, принятыми W.M.S. Russell и R.L. Burch в 1956 г.
Животных разделили на три группы (рис. 1). Мышам 1-ой группы в конъюнкти-вальный мешок после скарификации роговицы стерильной иглой закапывали 3 мкл вируссодержащей жидкости (титр ВПГ-1 равен 105 ЦПД50/0,1 мл) (n = 10). Мышам 2-ой группы в конъюнктивальный мешок после аналогичной травмы закапывали 3 мкл среды RPMI-1640 (группа сравнения, n = 10). Мыши 3-й группы были интактными, им не наносилось повреждение роговицы (группа контроля, n = 10). Наблюдение проводилось в динамике в течение 7 дней. У всех животных 1-й группы спустя сутки после инфицирования имели место клинические симптомы кератита: слезотечение, светобоязнь, блефароспазм, покраснение глаза. Для доказательства разви-
тия инфекции в роговице определяли ВПГ-1 с помощью метода nested-ПЦР в режиме реального времени. Для определения уровня экспрессии генов TLR9 и BD-2 методом ПЦР в режиме реального времени на 1-е, 3-и и 7-е сутки, после скарификации получали клетки эпителия роговицы (рис. 1).
Выделение РНК из клеток роговицы проводили с использованием комплектов реагентов RNeasy Mini Kit Qiagen и «РИБО-сорб» (ИЛС, РФ) строго в соответствии с протоколами. Выделенную РНК хранили при температуре — 70 OC. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили с использованием реагентов Qiagen OneStep RT-PCR Kit и обратной транс-криптазы (СибЭнзим, РФ) по инструкции фирмы производителя. Праймеры и зонды, используемые в реакциях ОТ-ПЦР, были подобраны к последовательностям мРНК (TLR9, BD-2) с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол, РФ. Для проведения ПЦР использовали реакционную смесь, которую готовили из реактивов «Набора для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» (Синтол, Россия), согласно рекомендациям фирмы-производителя. После приготовления реакционных смесей пробирки помещали в амплификатор для ПЦР-РВ АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, РФ). Реакцию проводили при следующем температурном режиме: 50 оС — 5 мин, 95 оС — 5 мин,
Скарификация Получение соскоба с роговицы, определение ВГП роговицы и и уровня экспрессии генов ТЬЯ9 и ЕШ2
Скарификация Получение соскоба с роговицы, определение ВГП роговицы и и уровня экспрессии генов Т1Л9 и ВБ2
Получение соскоба с роговицы, определение ВГП
0 1 234567 сутки
Рис. 1. Схема эксперимента РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2010, том 4(13), № 2
(64 оС - 50сек, 95 оС - 20 сек) - 40 циклов. Расчет данных производился с помощью программного обеспечения, прилагаемого к прибору АНК-32. Данные по экспрессии генов представлены в десятичных логарифмах (относительно 1 млн. копий гена р-актина) [11].
Статистический анализ полученных данных производился с помощью программы Exel Word. В группах определяли средние значения, стандартное отклонение. Для оценки статистической достоверности различий экспрессии генов в исследуемых группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рисунке 2 представлен процент животных, у которых выявлялся ВПГ-1 в роговице в зависимости от сроков после инфицирования. На 1-е сутки после заражения ВПГ-1 выявлялся в роговице у 34% мышей, через 3-е суток — у 89%; на 7-е сутки количество инфицированных мышей снижалось и составляло 60%. Модель развития герпес-вирусной инфекции в роговице в дальнейшем была использована для изучения показателей врожденного иммунитета, а именно экспрессии генов сигнального рецептора TLR9 и эффек-торной молекулы противомикробного пептида BD-2.
У интактных животных (3-я группа) уровень экспрессии TLR9 в эпителии роговицы составил 6,97±1,32. У мышей 2-й группы уровень экспрессии TLR9 не отличался от уровня экспрессии этого гена у интактных мышей
О сут
1 сут
3 сут
7 сут
во все сроки исследования. В роговице мышей, инфицированных вирусом (1-я группа), наблюдалось достоверное по отношению ко 2-й и 3-й группам снижение (в 100 раз и более) уровня экспрессии гена ТЬИ9 в течение всех сроков наблюдения (рис. 3А). Уровень экспрессии гена противомикробного пептида ББ-2 в клетках эпителия роговицы у интактных животных (3-я группа) составил 4,24 ± 0,45. У животных 2-й группы уровень
10-
-
• - • • *
1 сут
3 сут
7 сут
группа 1
группа 2
1 сут
3 сут
7 сут
группа 1
группа 2
Рис. 2. Динамика выявления ВПГ-1 в клетках роговицы мышей С57/Б1 после инфицирования (в %). По оси абсцисс — время (сутки), по оси ординат — процент инфицированных мышей (%).
Рис. 3. Изменение количественных уровней экспрессии генов ТЬЯ9 (А) и ББ2 (Б) в эпителиальных клетках роговицы у мышей исследуемых групп в динамике. По оси абсцисс — сроки наблюдения (сутки); по оси ординат — 1д (количество копий мРНК генов ТЬИ9 и ББ-2) относительно кол-ва копий р-актина мыши.
*значение достоверно отличается от показателя в группе 2 (р<0,05).
Серым цветом на рисунке отмечена зона значений показателя в группе интактных мышей.
190
В.А. Черешнев и др.
цитоплазма
Провоспа-лительные i
цитокины <=1 (IL-1, TNFa, IL-6, IL-8 и др.)
V ядро
пептиды
Рис. 4. Активация TLR9 индуцирует каскад адаптерных молекул
экспрессии был, соответственно, 3,40 ± 0,48; 2,984 ± 0,57; 3,937 ± 1,03 и достоверно не отличался от уровня интактных животных. Экспрессия гена ББ-2 у животных 1-й группы на 1-е, 3- и 7-е сутки составила, соответственно, 4,02 ± 0,39; 5,25 ± 1,58; 4,07 ± 1,79, однако достоверное увеличение экспрессии имело место лишь на 3-и сутки (рис. 3Б), когда герпетический кератит развивался у 89% мышей.
Можно предположить, что столь выраженное угнетение экспрессии гена ТЬИ9 вызывает вирус. Выявленное изменение экспрессии ТЬИ9 можно рассматривать как один из ключевых механизмов, с помощью которого вирус уклоняется от иммунного надзора. Новый, недавно открытый, механизм супрессии врожденного иммунитета при действии ВПГ-1 описан в работе [9]. Вирусный белок 1СРО, играющий важную роль в переходе ВПГ-1 из латентного состояния в состояние реактивации, ингибирует То11-опосредованный воспалительный ответ, блокируя ядерный фактор транскрипции NF-kB через адапторную молекулу TRAF6 сигнального пути ТЬИ9. Это снижение, соответственно, приводит к супрессии выработки провоспалительных цито-
кинов, в частности, TNFa, блокирующего репликацию ВПГ-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.