ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 453, № 6, с. 694-696
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.21
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ В ОБРАЗЦАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2013 г. Л. О. Скородумова, М. И. Лукашина, Л. Е. Сальникова, О. А. Тихонова, С. Ю. Иванов, С. С. Ларин
Представлено академиком Г.П. Георгиевым 29.08.2013 г. Поступило 13.06.2013 г.
БО1: 10.7868/80869565213360310
цРак молочной железы (РМЖ) является самым распространенным злокачественным новообразованием у женщин в Российской Федерации (56154 выявленных случаев в 2012 г.), который приводит к смерти более 20000 пациентов каждый год [1]. Несмотря на достижения диагностики и терапии рецидивирование РМЖ остается актуальной проблемой [2]. Рациональным подходом к снижению частоты рецидивов РМЖ после первичного лечения является иммунотерапия. Раково-тестикулярные (РТ) антигены являются перспективными мишенями для разработки иммунотерапии РМЖ. В норме РТ-антигены экс-прессируются преимущественно в зародышевых клетках человека и в трофобласте, а аберрантно их экспрессия индуцируется в опухолях [3].
Возможность использования РТ-содержащих вакцин в значительной степени определяется частотой экспрессии РТ-антигенов опухолевыми тканями [4]. РМЖ в данном аспекте изучен недостаточно. Результаты исследований экспрессии РТ-генов в РМЖ сильно варьируются, например, диапазон частот экспрессии МУ-Б80-1 составляет 10—55% [5—9]. В большой степени столь значительная изменчивость результатов может объясняться популяционными особенностями [8].
Ранее в ИБГ РАН была разработана генно-кле-точная противоопухолевая вакцина "Компли-вак", содержащая в своем составе набор РТ-анти-генов (табл. 1) [10, 11]. Перспективы ее применения для лечения больных с РМЖ не ясны, так как исследования экспрессии РТ-генов в образцах РМЖ у российских пациенток до настоящего
Институт биологии гена
Российской Академии наук, Москва
Федеральный научный клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии
им. Дмитрия Рогачева, Москва
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова
Российской Академии наук, Москва
Нижегородская государственная медицинская академия
времени не проводились. В связи с этим целью работы явилось изучение экспрессии РТ-генов в опухолевых тканях молочной железы у российских пациенток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Был исследован 41 образец РМЖ 1.1—41.1 и три парных образца нормальной ткани молочной железы, иссеченной также при операции по удалению опухоли (3.2—5.2). Все молекулярно-биологи-ческие этапы исследования выполняли в соответствии с инструкциями производителей соответствующих наборов и реактивов. Для немедленной стабилизации РНК в хирургическом материале использовали стабилизирующий буфер RNA Stabilization Reagent, RNAlater® ("Qiagen", США). Тотальную РНК выделяли с помощью RNeasy Protect Mini Kit ("Qiagen", США). Для разрушения следов ДНК тотальную РНК обрабатывали ДНКазой RQ1 RNase-Free DNase ("Promega", США). Для проведения обратной транскрипции (ОТ) использовали набор Rever-tAid™ Revert Transcriptase M-MuLV ("Fermentas", Литва). В одну реакционную пробу вносили 1—
Таблица 1. Сопоставление профиля экспрессии РТ-ге-нов в образцах РМЖ и в клеточных линиях, входящих в состав вакцины "Компливак"
л
а I
а §
а- «
3 о
Я
о ч о
св ft VO
О
BAGE2, BAGE3 « я я я ч «
MAGE-A3 CN « Я я я ч «
MAGE-A6
MAGE-A10 се Я
MAGE-A12 о н о се Я
NY-ESO-1 ¡3 О н о
MAGE-A4 и
GAGE2-GAGE8
LAGE-1a
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ
695
1.5 мкг РНК. В качестве олигонуклеотидных затравок использовали Random Hexamer Primer ("Fermentas", Литва), а для ингибирования РНКаз RNa-sin® Ribonuclease Inhibitor ("Promega", США). Для каждого образца РНК проводили положительную и отрицательную реакцию ОТ. Для проведения ПЦР с кДНК образцов использовался набор реагентов для молекулярно-генетической диагностики раково-тестикулярных антигенов методом полимеразной цепной реакции (РТ-ан-тиген) (ИБГ РАН, Россия). В данный набор входит все необходимое для детекции экспрессии РТ-генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, GAGE (гены CT4.2-GAGE4.8), NY-ESO-1, LAGE-1a, BAGE (гены CT2.2, CT2.3) в биологических образцах пациента. Для каждого образца качество синтезированной кДНК оценивали по экспрессии гена GAPDH (соответствующие прайме-ры также входят в состав набора "РТ-антиген"). Учет результатов ПЦР проводили методом горизонтального электрофореза. Специфичность ПЦР-продуктов была проверена с помощью секвенирова-ния в Межинститутском центре коллективного пользования "ГЕНОМ" ИМБ РАН (http://www.ge-nome-centre.narod.ru/).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В норме РТ-гены не экспрессируются в ткани молочной железы, поэтому пробы гистологически нормальной молочной железы пациенток с РМЖ служили отрицательным контролем. Так как ни в одном из образцов нормальной ткани не было детектировано экспрессии РТ-генов, то можно полагать, что подобранные условия анали-
Таблица 2. Частота экспрессии РТ-генов в образцах рака молочной железы, %
Ген Количество образцов, экспрессиру-ющих ген, % Частота экспрессии гена (всего 41 образец) Частота экспрессии гена по литературным данным
MAGE-A3 7 17.1% 10-14 [6, 7, 12]
MAGE-A4 11 26.8% 4-13 [6, 12]
MAGE-A6 7 1 7.1 % 15 [12]
MAGE-A10 5 12.2% 7.6 [9]
MAGE-A12 9 22.0% 9 [12]
GAGE2- 4 9.8% 8-26 [6, 7]
GAGE8
NY-ESO-1 17 41.5% 10.1-54.8 [5-7, 9]
LAGE-1a 2 4.9% 3.1-5.4 [5, 9]
BAGE2, 2 4.9% 2-10 [7, 9]
BAGE3
за экспрессии выбранных РТ-генов позволили избежать ложноположительных результатов.
Далее было проведено собственное исследование образцов рака молочной железы. На рис. 1 приведены результаты исследования экспрессии РТ-генов MAGE-A3, -А4, -А6, -А10, -А12, НУ-ЕБ0-1, LAGE-1a, GAGE2-GAGE8, БА^Е2, BAGE3 в образцах 1.1-9.1 РМЖ.
В табл. 2 суммированы результаты, касающиеся всех проанализированных образцов РМЖ.
K+ K 1.1 +- 2.1 +- 3.1 +- 4.1 +- 5.1 +- 6.1 +- 7.1 +- 8.1 +- 9 +- M Название гена
--250 п.н. GAPDH
— - -2 50 п.н. MAGE-A3
— — — ^■-250 п.н. MAGE-A4
— — — -2 50 п.н. MAGE-A6
•• — -250 п.н. MAGE-A10
— -250 п.н. MAGE-A12
mm -250 п.н. GAGE2-GAGE8
mm mm •• -250 п.н. NY-ESO-1
• -250 п.н. LAGE-1a
m — -250 п.н. BAGE2, BAGE3
Рис. 1. Результаты детекции продуктов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле, где Кч— положительный контрольный образец, К--отрицательный контрольный образец, 1.1—9.1 — образцы РМЖ, плюс — положительная проба ОТ, минус — отрицательная проба ОТ, М — маркёр молекулярного веса ДНК.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 453 № 6 2013
696
СКОРОДУМОВА и др.
В результате нашей работы впервые получены данные о частоте экспрессии РТ-генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, GAGE2- GAGE8, BAGE2 и BAGE3, NY-ESO-1, LAGE-1a в тканях пациенток с РМЖ в Российской Федерации. Всего экспрессия хотя бы одного из исследованных генов была детектирована в 27 из 41 образца (65.7%), двух генов — в 6 образцах (14.6%), трех и более генов — в 8 образцах (19.5%). Частоты экспрессии генов NY-ESO-1, BAGE2, BAGE3, LAGEla, GAGE2-GAGE8 аналогичны описанным в других популяциях [5—7, 9, 12]; для генов MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12 — несколько отличаются [6, 7, 9, 12]. Особо следует отметить высокую частоту экспрессии NY-ESO-1 (более 40% образцов). Иммунный ответ на NY-ESO-1 обычно проявляется как выработкой антител, так и формированием CD4+ и CD8+ NY-ESO-1-специфичных Т-клеток, что позволяет наиболее эффективно воздействовать на опухоль [13].
Поливалентные вакцины, разработанные в ИБГ РАН, содержат набор опухолевых антигенов, комплементарный спектру экспрессии РТ-генов в исследованных образцах. Показанная в настоящей работе достаточно высокая частота экспрессии РТ-генов обусловливает целесообразность дальнейших исследований потенциала противоопухолевых вакцин, содержащих РТ-антигены, для иммунотерапии российских пациенток с различными клиническими формами РМЖ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Состояние онкологической помощи населению России в 2012 году. М.: ФГБУ МНИОИ им. П.А. Герцена Минздрава России, 2013. 232 с.
2. Ahmad A. // ISRN Oncol. 2013. P. 290568.
3. Hofmann O., Caballero O.L., Stevenson B.J., Chen Y.T., Cohen T., Chua R., Maher C.A., Panji S., Schaefer U., Kruger A., Lehvaslaiho M., Carninci P., Hayashizaki Y., Jongeneel C.V., Simpson A.J., Old L.J., Hide W. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 51. P. 2042220427.
4. Бережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Козлов А.М., Ларин С.С. Вопр. онкологии. 2008. Т. 54. № 6. С. 669-683.
5. Mashino K., Sadanaga N., Tanaka F., Yamaguchi H., Nagashima H., Inou H., Sugimachi K., Mori M. // Brit. J. Cancer. 2001. V. 85. № 5. P. 713-720.
6. Mischo A., Kubuschok B., Ertan K., Preuss K.D., Romeike B., Regitz E., Schormann C., de Bruijn D., Wadle A., Neumann F., Schmidt W., Renner C., Pfreundschuh M. // Intern. J. Cancer. 2006. V. 118. № 3. P. 696-703.
7. Sahin U., Tureci O., Chen Y.T., SeitzG., Villena-Heins-en C., Old L.J., Pfreundschuh M. // Intern. J. Cancer. 1998. V. 78. № 3. P. 387-389.
8. Sugita Y., Wada H., Fujita S., Nakata T., Sato S., Noguchi Y., Jungbluth A.A., Yamaguchi M., Chen Y.T., Stockert E., Gnjatic S., Williamson B., Scanlan M.J., Ono T., Sakita I., Yasui M., Miyoshi Y., Tamaki Y., Matsuura N., Noguchi S., Old L.J., Nakayama E., Monden M. // Cancer Res. 2004. V. 64. № 6. P. 21992204.
9. Taylor M., Bolton L. M., Johnson P., Elliott T., Murray N. // Cancer Res. 2007. V. 9. № 4. P. R46.
10. Larin S.S., Korobko E. V., Kustikova O.S., Boroduli-na O.R., Raikhlin N.T., Brisgalov I.P., Georgiev G.P., KiselevS.L. // J. Gene Med. 2004. V. 6. № 7. P. 798808.
11. Бережной А.Е., Сапрыкина Н.С., Барышников А.Ю., Ларин С.С., Козлов А. М. // Рос. биотерапевт. журн. 2006. Т. 5. № 4. С. 47-53.
12. Otte M., Zafrakas M., Riethdorf L., Pichlmeier U., Loning T., Janicke F., Pantel K. // Cancer Res. 2001. V.61. № 18. P. 6682-7.
13. Nicholaou T., EbertL., D
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.