ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 1, с. 20-29
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ ^
УДК 577.218, 577.151.042
ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ ДЕКОНДЕНСАЦИИ ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ТЕХНИКИ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ © 2011 г. Е. В. Семенова, М. В. Филатов
Отделение молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН 188300 Гатчина, Ленинградская обл., Орлова роща E-mail: filatov@omrb.pnpi.spb.ru Поступила в редакцию 04.02.10 г. Окончательный вариант 11.03.10 г.
Механизмы, обуславливающие радикальное изменение структуры хроматина мужских половых клеток в процессе оплодотворения, остаются во многом неясными. В данной работе представлены аргументы, указывающие на возможность существования энзимов с протеолитической активностью в ядрах зрелых сперматозоидов человека, и обсуждается предполагаемая роль этих неизвестных ранее эндогенных протеолитических активностей в декомпактизации хроматина сперматозоидов в оплодотворенной яйцеклетке. С помощью техники проточной цитометрии продемонстрировано, что обработка ядер сперматозоидов человека SH-содержащими реагентами не только разрушает дисульфидные связи между молекулами протаминов, что необходимо для их эффективного удаления, но также индуцирует специфическую эндогенную протеазную активность, следствием чего является достаточно быстрая деконденсация хроматина, сопровождающаяся протеоли-зом ядерных белков. Процесс деконденсации хроматина практически полностью блокируется различными ингибиторами сериновых протеаз и компонентами семенной жидкости. С целью визуализации мест локализации белков с протеолитической активностью в ядрах мужских половых клеток использован оригинальный цитохимический подход — связывание флуоресцентно меченого ингибитора протеаз с исследуемым объектом.
Приведенные в работе факты позволяют предположить, что одним из факторов реорганизации структуры хроматина при формировании мужского пронуклеуса в процессе оплодотворения может быть эндогенная ядерная протеаза сперматозоида, активирующаяся под действием глутатиона или других SH-содержащих реагентов, которыми богата цитоплазма яйцеклетки.
Ключевые слова: ингибиторы протеаз, оплодотворение, проточная цитометрия, сперматозоиды человека, эндогенные ядерные протеазы.
Один из важнейших этапов процесса оплодотворения у человека — радикальная реорганизация структуры ядра мужских половых клеток после слияния с яйцеклеткой. Хроматин зрелых сперматозоидов отличается от хроматина других типов клеток не только по составу, но и по значительно более высокой степени компактизации: обычные гистоны почти на 85% замещаются специфическими основными белками протаминами, что ведет к практически полному отсутствию нуклеосомной организации ДНК; кроме того, дополнительная стабилизация достигается за счет формирования дисульфидных мостиков между молекулами протаминов. Очевидно, что после проникновения сперматозоида в яйцеклетку необходима обратная реорганизация хроматина и, следовательно, должны существовать факторы, обеспечивающие эффективность данного процесса, т.к. нарушение запрограммированной структурной перестройки хроматина сперматозоидов может привести к образованию дефектного мужского пронуклеуса и негативно повлиять на ранние стадии
эмбриогенеза. В ооплазме инициируется декомпак-тизация плотно упакованного хроматина мужских половых клеток, сопровождающаяся заменой протаминов гистонами (Newport, 1987; Almouzni et al., 1990, 1991; Kleinchmidt, Steinbeisser, 1991; Almouzni, Wolffe, 1993; Bianchi et al., 1996; McLay, Clarke, 2003; van der Heijden et al., 2005; Ajduk et al., 2006). В результате генетический материал приобретает характерную для соматических клеток нуклеосомную структуру, что делает возможным его объединение в одном ядре с женским пронуклеусом и последующую адекватную экспрессию генетической информации. Однако молекулярно-клеточные механизмы, обуславливающие такую радикальную реорганизацию хроматина сперматозоидов, остаются во многом неясными.
Протеолиз играет весьма существенную роль при оплодотворении у млекопитающих. Известно, что протеолитические события сопровождают начальные этапы узнавания и взаимодействия яйцеклетки
и сперматозоида, лежат в основе разрушения спер-мийных митохондрий в ооците (Imschenetzky et al., 1999; Mochida et al., 2000; Sutovsky et al., 2000; Wojcik et al., 2000; Ziemba et al., 2002; Sutovsky, 2003; Yi et al., 2007; Chakravarty et al., 2008; Rawe et al., 2008; Zimmerman, Sutovsky, 2009). Протеазы участвуют и в реорганизации хроматина сперматозоида при формировании мужского пронуклеуса (Chang, Zirkin, 1978; Zirkin et al., 1980; Perreault, Zirkin, 1982; Marushige Y, Marushige K., 1983; Imschenetzky et al., 1997; 1999; Shimada et al., 2000; Concha et al., 2005; Monardes et al., 2005; Puchi et al., 2006; Gourdet et al., 2007; Irib-arren et al., 2008; Morin et al., 2008). Что касается человека, то информация об обнаружении протеоли-тических ферментов в ядрах мужских половых клеток в литературе отсутствует.
В данной работе представлен ряд фактов, указывающих на то, что ядра зрелых сперматозоидов человека содержат энзимы, обладающие протеолити-ческой активностью, определены условия их активации и места преимущественной локализации в ядре. Предполагается, что эти белки принимают участие в запрограммированной структурной перестройке хроматина в оплодотворенной яйцеклетке, по всей видимости, осуществляя протеолиз спер-мий-специфичных протаминов и белков ядерного матрикса, что способствует быстрой деконденсации хроматина и последующему восстановлению нукле-осомной организации мужского генома.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Стандартная процедура окрашивания клеток бромистым этидием
для проточноцитометрических исследований
В каждом эксперименте использовались небольшие объемы семенного материала (0.5 мл). Сперматозоиды освобождали от семенной жидкости путем центрифугирования (5 мин. при 2000 об./мин) с последующей двукратной отмывкой в стандартном фосфатном буфере (150 мM PBS, pH 7.0) (БиолоТ С.-Петербург, Россия). Затем клетки переводили в тот же буфер (конечная концентрация 106 сперматозоидов в миллилитре), содержащий неионный детергент Triton Х-100 (конечная концентрация 0.1%) (БиолоТ, С-Петербург, Россия) для разрушения ци-топлазматической мембраны и освобождения ядер, стабильных в этих условиях. Окрашивание ядер интеркалирующим флуоресцентным красителем бромистым этидием (конечная концентрация 25 мкг/мл) (Sigma, St. Louis, MO, USA) проводили в течение 30 мин непосредственно перед проточ-ноцитометрическим анализом.
Исследования проводились на сконструированном и собранном в ПИЯФ РАН проточном лазерном цитофлуориметре, измеряющем интенсивность флуоресценции и использующем в качестве источника света аргоновый лазер. Суспензия клеток пода-
валась при помощи шприцевого микронасоса под давлением в проточную камеру через сопло-инжектор. Гидродинамическое фокусирование обеспечивалось оболочечной струей по мере выхода клеток из сопла. Возбуждение флуоресценции осуществлялось аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Мощность излучения около 0.5 Вт. Горизонтальный размер лазерного фокального эллипса 80 х 10-6 м, вертикальный размер — 18 х 10-6 м. Диаметр потока суспензии равен 12 х 10-6 м в момент пересечения лазерного луча. Сигнал флуоресценции после прохождения серийного объектива 30/0.9, выделялся двухмиллиметровым стеклянным светофильтром КС-10 и фокусировался на фотокатод ФЭУ-84. Импульсы с ФЭУ усиливались спектрометрическим усилителем и подавались на многоканальный амплитудный анализатор, соединенный с компьютером. Условия проведения эксперимента позволяли нам регистрировать приблизительно 500 импульсов в секунду. Обработка полученных данных производилась с помощью специальной программы накопления и графического представления, написанной в ПИЯФ РАН.
Обработка ядер сперматозоидов SH-содержащими реагентами и различными ингибиторами протеаз
После трехкратной отмывки, позволяющей избавиться от нежелательных для последующего анализа компонентов семенной жидкости (различных протеаз и ингибиторов протеаз) и инкубации с детергентом в течение 15 минут при комнатной температуре, клетки делили на 3 аликвоты и снова центрифугировали дважды (10 мин при 5000 об./мин) в изотоническом фосфатном буфере, pH 7.0. С помощью данной процедуры мы отмывались от акросо-мальных протеолитических активностей. Затем ядра одной из аликвот ресуспендировали в том же буфере (150 мМ PBS, pH 7.0), а двух других аликвот в 10 мМ PBS, pH 8.5 (конечная концентрация 106 сперматозоидов в миллилитре). Все три аликвоты обрабатывались ß-меркаптоэтанолом (конечная концентрация 20 мМ) (Сигма-Алдрич, Москва, Россия) или другими SH-содержащими реагентами (дитиотрей-тол, цистеамин, восстановленный глутатион (dithio-threitol, cysteamine, reduced glutathione; Sigma, St. Louis, MO, USA)), а к третьей аликвоте, кроме того, добавлялся раствор какого-нибудь ингибитора протеаз серинового типа (фенилметилсульфонил флуорид (PMSF; Sigma, St. Louis, MO, USA), N-то-зил^-фенилаланин хлорометил кетон (N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone; Sigma, St Louis, MO, USA), бензамидин (benzamidine; Fluka, Buchs, Switzerland), ингибитор трипсина соевых бобов (SB-TI; Fluka, Buchs, Switzerland)) (конечная концентрация 5—25 мM) или различные объемы семенной жидкости (разведение в 10, 100 и 1000 раз). В заключение ядра сперматозоидов окрашивались по стандартной методике.
Приготовление флуоресцентно меченого ингибитора трипсина соевых бобов
Ингибитор трипсина соевых бобов (SBTI; Fluka, Buchs, Switzerland) был растворен в 0.1 N содовом буфере (5 мM Na2CO3, 90 мM NaHCO3; НеваРеак-тив, С.-Петербург, Россия), pH 8.9 до конечной концентрации 200 мг/мл. К раствору был добавлен флу-орохром флуоресцеин изотиоцианат (FITC, isomer I; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) (конечная концентрация 1 мг/мл), и при непрерывном помешивании смесь инкубировалась в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего была нанесена на колонку с G-50 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Sweden), уравновешенную водой. В заключении продукт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.