ПОВЕРХНОСТЬ. РЕНТГЕНОВСКИЕ, СИНХРОТРОННЫЕ И НЕЙТРОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2011, № 9, с. 54-61
УДК 533.9:538.9
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КАЛЬЦИЙФОСФАТНЫХ ПОКРЫТИЙ, СОЗДАННЫХ МЕТОДОМ ВЧ-МАГНЕТРОННОГО РАСПЫЛЕНИЯ
КРЕМНИЙЗАМЕЩЕННОГО ГИДРОКСИАПАТИТА © 2011 г. В. Ф. Пичугин1, М. A. Сурменева1, Р. А. Сурменев1, И. А. Хлусов1, М. Эппле2
1Томский политехнический университет, НОЦ "Биосовместимыематериалы и биоинженерия"при ТПУи СибГМУ,
Томск, Россия
2Институт неорганической химии, Дуйсбург-Эссен университет, Эссен, Германия Поступила в редакцию 04.10.2010 г.
Покрытия на основе чистого и кремнийзамещенного гидроксиапатита были получены методом ВЧ-магнетронного распыления. Морфология поверхности, фазовый и элементный состав покрытий исследованы методами растровой электронной микроскопии, энергодисперсионного рентгеновского анализа, инфракрасной спектроскопии. Покрытия рентгеноаморфны, их элементный состав определяется составом мишени для распыления. Распределение элементов по поверхности покрытия равномерное. Медико-биологические свойства покрытий исследованы in vivo и in vitro. Исследована способность покрытий вызывать подкожный рост костной ткани. Покрытия, полученные распылением мишени из стехиометрического гидроксиапатита, обладают биосовместимостью, но не стимулируют рост кости. Введение силикат-иона в структуру гидроксиапатита, формирующего электрод-мишень, значительно увеличивает in vivo влияние покрытий на остеогенную (костеобразующую) активность стромальных стволовых клеток костного мозга.
ВВЕДЕНИЕ
Современная тенденция медицинского материаловедения заключается в "регенерационном" подходе, т.е. создании и использовании материалов, которые взаимодействуют с организмом и стимулируют восстановление ткани. Необходимая совместимость поверхности медицинских имплантатов с биологическими тканями достигается за счет применения имплантатов комбинированной конструкции, характеризуемых наличием прочной металлической основы и покрытия из биосовместимого материала, который может представлять специально сформированный слой фосфатов кальция (далее СаР).
Различные образцы кальцийфосфатных материалов, в зависимости от их физико-химических свойств (степень кристалличности и пористости, растворимость, шероховатость поверхности, элементный и фазовый состав и т.д.), обладают разной способностью поддерживать костеобразование [1]. Физико-химические и биомедицинские свойства имплантатов взаимосвязаны и находятся в тесной зависимости от способа формирования поверхностного искусственного слоя [2]. Тем не менее, до сих пор не удалось найти ключевое сочетание структуры, толщины и скорости растворения различных покрытий для реализации костеобразую-щего потенциала стромальных стволовых клеток и успешной интеграции имплантатов с костью. В настоящее время оптимальным материалом для использования в клинической практики считается
кальцийфосфатная керамика на основе гидроксиапатита (ГА) Ca10(PO4)6(OH)2 (декакальций гекса-фосфат дигидроксид) и трикальциевого фосфата Ca3(PO4)2 (трикальцийфасфат), структура которых близка к структуре минеральной составляющей костной ткани. Плотная биосовместимая гидрок-сиапатитовая керамика является малоактивным материалом, при ее использовании крайне замедлены процессы резорбции имплантата и кинетика роста контактной костной ткани [3—5]. Увеличить биологическую активность ГА можно двумя путями: уменьшить размеры кристаллитов (благодаря чему увеличивается удельная поверхность) и изменить физико-химические характеристики поверхности, то есть химически ее модифицировать. При втором подходе появляется возможность создать материалы, которые активно резорбируют при контакте с жидкостями организма.
Перспективным считают кремнийсодержащий гидроксиапатит Са10(РО4)6-х(8Ю4)х(НО)2-х (Si—ГА),
так как анионы оксида кремния (SiO^-) являются естественной компонентой межтканевой жидкости [5]. Si—ГА в качестве перспективного биоматериала изучается относительно недавно, в основном в системе ex vivo. Отмечается, что присутствие кремния в составе стеклокерамики и гидроксиапатита ускоряет их интеграцию с костной тканью [6] и растворение in vitro и in vivo [7—8]. Так, Тиан Е.С. и др. [9] описали in vitro позитивную реакцию остеобласто-
подобных клеток на покрытия 81—СаР, нанесенные методом магнетронного напыления.
Основными технологическими методами формирования биосовместимых покрытий являются плазменное напыление [10—11], метод лазерной абляции [12], методы, основанные на кристаллизации покрытий из различных растворов [13—14], а также высокочастотное (ВЧ) магнетронное распыление [15—17]. В ряде методов при нанесении покрытия исходное вещество изменяется, и покрытие представляет собой новую, часто многофазную, систему. Важно, чтобы применяемый метод позволял сохранять химический состав исходного материала при нанесении покрытия на имплантат. Метод ВЧ-маг-нетронного распыления отвечает этому требованию, более того, он позволяет варьировать элементный и фазовый состав покрытия как путем изменения состава исходной мишени для распыления, так и изменением параметров напыления (мощность разряда, рабочий газ и др.) [18]. Другое неоспоримое преимущество этого метода — высокая адгезионная прочность покрытий. В работе [9, 19] для формирования покрытий 81—СаР использовались две отдельные мишени для распыления, приготовленные из кремния и незамещенного ГА.
Объектами исследования данной работы служили покрытия, сформированные методом ВЧ-магне-тронного распыления мишеней, приготовленных из чистого ГА и 81—ГА. Биологическая совместимость материалов обусловлена определенным уровнем их биологических и физико-химических свойств, к которым относятся токсичность, стимулирование опухолеобразования, воздействие на кровь, а также химический состав и геометрические свойства (рельеф). Задачами данной работы являлись исследование физико-химических свойств покрытий, сформированных методом ВЧ-магнетрон-ного распыления и влияния рельефа искусственной поверхности на реакцию культуры клеток, а также изучение остеогенного (костеобразующего) потенциала покрытий, созданных на основе стехиомет-рического и кремнийзамещенного гидроксиапати-та в сравнительном аспекте.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для напыления покрытий использовалась промышленная установка 08ПХО-100Т-005 с магнетронным источником (5.28 МГц). Рабочие параметры: давление 0.1 Па (предельное давление в вакуумной камере 10-4 Па), расстояние между мишенью и подложками 40 мм, рабочий газ аргон, мощность ВЧ-генератора 250 Вт. Материалом для изготовления мишени служил порошок кремнийзамещенного гидроксиапатита, синтезированного механохимическим методом с содержанием кремния 4.9 мас. %, что соответствует формуле Са1о(Р04)4.28(8Ю4)1.72(ОН)о.28. Дан-
ный способ позволяет получать равномерные по составу покрытия. Ранее нами было показано [20], что, в отличие от исходного порошка, материал мишени представляет собой двухфазную биокерамику на основе стабилизированного кремнием кристаллического ГА (фазовый состав Si—ГА не отличается от фазового состава ГА [7, 21]) и трикальцийфосфа-та. Для сравнительных исследований была приготовлена мишень из синтезированного механохими-ческим методом чистого ГА. Мишень для ВЧ-маг-нетронного распыления (диаметр 220 мм, толщина 10 мм) была приготовлена по керамической технологии: прессование порошка при давлении 70 МПа, затем отжиг полученной пресс-формы при температуре 1100оС в течение одного часа на воздухе. В качестве подложек для напыления использовались KBr (для исследования молекулярных связей в покрытии методом ИК-спектроскопии) и технически чистый титан ВТ1-0.
Исследования морфологии и элементного состава полученных покрытий проводились с использованием растрового электронного микроскопа (РЭМ) Quanta 200 ESEM FEG фирмы FEI со встроенной приставкой для энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDX). Для определения фазового состава сформированного покрытия Si—СаР и не содержащего кремний СаР-покрытия использовался рентгенофазовый анализ (дифрактометр Shi-madzu XRD-7000). Для интерпретации дифракто-грамм использовалась база данных International Center for Diffraction Data (ICDD): номер карточки для синтетического ГА 9-432; для титана — 44-1294. Для выявления химических связей фосфатной и замещающей групп применялся метод инфракрасной (ИК) спектроскопии. Спектры оптического поглощения получены на приборе Bruker Vertex 70 в диапазоне частот 400—4000 см-1.
Методика медико-биологических исследований.
Для исследования реакции клеток на прямой контакт с поверхностью использовалась культура стволовых фибробластоподобных клеток легкого человека (ООО "Банк стволовых клеток", г. Томск). Препараты представляют собой популяцию клеток с ограниченным сроком жизни, сохраняющую при пассажах ex vivo стабильный кариотип и онкогенно безопасную. Клетки свободны от посторонних вирусных (ВИЧ, гепатит, герпес и др.) и бактериальных (сифилис, микоплазмы, хламидии и др.) агентов. После размораживания жизнеспособность клеток, определяемая согласно ISO 10993-5 в тесте с 0.4% трипановым синим, составила 93%.
Изучаемые изделия помещали в лунки 24-луноч-ных планшетов (Costar), добавляли клеточную взвесь в концентрации 5 х 104 жизнеспособных ка-риоцитов (ядросодержащих клеток) в 1 мл остеоген-ной среды следующего состава: 20% инактивиро-ванной при 56°С эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мМ бета-
глицерофосфата, 10-6 М дексаметазона, 50 мг/л гентамицина, 280 мг/л L-глутамина, 10 мМ HEPES-буфера, DMEM среды до 100 мл. Контролем роста служила культура фибробластоподобных клеток на пластике.
Через четверо суток имплантаты удаляли, сушили на воздухе. Подготовку образцов с клетками, прилипающими к поверхности, для РЭМ проводили согласно [22]. Осуществляли фиксацию адгези-рующих к покрытию клеток в течение 30 мин в 2.5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере, затем в 1% растворе четырехокиси осмия в течение 30—40 мин с последующим двукратным отмыванием фосфатным буфером (рН 7.2—7.4). Далее производили обезвоживание клеток в серии в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.